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《山东农业大学》 2011年
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小麦春化相关基因TaVRN2和NF-Y家族基因TaNF-YB3的分离与功能分析

董秀春  
【摘要】:开花是植物生长发育的核心过程,小麦(Triticum aestivum L.)作为一种重要的粮食作物,其开花时间主要受春化作用途径和光周期途径两方面的调节。为了理解小麦开花时间的分子调控机制,本研究分离了小麦开花时间基因TaVRN2,光周期基因CO(WCO1和TaHd1)以及NF-Y(HAP)家族基因,从序列分析和蛋白互作方面研究了它们之间的关系;并对小麦TaVRN2和TaNF-YB3基因的表达模式与生物学功能进行了深入研究。主要结果如下: 1.TaVRN2基因的序列特征 小麦VRN2基因位点含有ZCCT1和ZCCT2两个基因,我们从六倍体小麦烟农15分离到ZCCT-A1、ZCCT-B1、ZCCT-D1、ZCCT-A2和ZCCT-D2基因,分别含有一个长度为621bp、642bp、639bp、639bp和639bp的开放阅读框,对应地编码206、213、212、212和212个氨基酸残基组成的蛋白。这些蛋白均含有一个锌指结构和一个典型的由43个氨基酸组成的CCT-domain区域,VRN2蛋白在CCT-domain发生了一定的点突变,如ZCCT-A1的R39C,ZCCT-A2的R/K16C。氨基酸序列比较分析与系统进化树分析表明TaVRN2蛋白与其他植物中的同系物高度同源,与单子叶植物的大麦HvZCCT-Ha和HvZCCT-Hb的亲缘关系较近,其次是大麦的CO-like蛋白HvCO9,而与双子叶植物拟南芥的CO-like蛋白亲缘关系相对较远,并且拟南芥中没有VRN2的同源蛋白。 2.小麦CO基因和NF-Y家族基因的序列分析 分离了六倍体小麦CO的2个候选基因WCO1和TaHd1的编码区全长序列,得到WCO1-2、WCO1-13和WCO1-16三个不同的克隆,以及一个TaHd1-3基因;同时还分离到小麦NF-Y家族的12个基因,即NF-YA的1、3、5、7和NF-YA9的2个不同克隆(NF-YA9-8和NF-YA9-13)基因,NF-YB的3、4、8和11四个基因,NF-YC的6、7和14三个基因。获得的这些小麦CCT-domain相关蛋白以及拟南芥AtCO蛋白的CCT-domain区域,与NF-YA蛋白亚族的核心区域进行氨基酸序列对比,结果表明CCT-domain在这些CCT-domain蛋白中高度保守,并与NF-YA蛋白的核心序列相对保守。NF-YA蛋白包括一个NF-YB/YC结合区、一个接头序列(Linker)和一个DNA结合区,在各物种间保守;NF-YB和NF-YC蛋白的核心区也含有与其他亚基互作和DNA结合所必需的区域,NF-YB亚族彼此间相对保守,但是NF-YC间的相似性则很低。 3.小麦TaVRN2、CO与NF-Y的互作关系 酵母双杂交实验初步检测了获得的小麦CCT-domain类蛋白与NF-YB和NF-YC的互作情况,但仍需要进一步证实。 4.TaVRN2基因的表达分析 实时定量RT-PCR检测了TaVRN2基因的部位表达模式,结果表明其主要在早期营养生长的叶片中表达,其他器官和生殖生长阶段表达很低或不表达,而且研究也揭示ZCCT1基因的表达水平在同等条件下均较高于ZCCT2基因。同时,定量RT-PCR的结果也揭示小麦ZCCT1和ZCCT2在LD和SD条件都呈现节奏性表达,并且在光结束时达到表达高峰,而且ZCCT1一般比ZCCT2提前2h到达峰值。这说明TaVRN2受日照长度和生物钟的调控。 5.TaVRN2基因的生物学功能分析 除了对TaVRN2基因的序列和表达特性进行分析外,我们还对该基因的生物学功能进行了深入的分析。Ubi::ZCCT-A1转基因二穗短柄草Bd21,在LD条件推迟开花,强表型的开花时间大于1.5个生长周期的,野生型6-7片叶开花,强晚花表型13片叶仍处于营养生长。但是,给予4周的春化处理,可以打破晚花表型,使开花时间较野生型晚5天左右,而给予6周的春化处理则达到饱和点,与野生型开花时间完全一致。而且,转基因植株中,春化相关基因VRN1的表达水平明显下降,VRN3的也降低,但VRT2-like基因的表达水平呈上升状态。这表明ZCCT-A1的过量表达导致晚花与其他春化基因的表达水平变化有关联。 6.小麦TaNF-YB3基因的序列分析 小麦TaNF-YB3基因近全长cDNA含有809个核苷酸,编码199个氨基酸。基因组定位结果显示此基因位于D基因组的3号染色体。与水稻、拟南芥、人类和酵母的HAP3的同源性分析揭示,TaNF-YB3与水稻OsHAP3I的同源性最高,达85%,和拟南芥AtNF-YB3也具有较高的同源性(65%)。但与酵母和人类的较低,分别为50%和47%。进化树分析结果表明其属于不参与胚胎形成的non-LEC1-like分支,与水稻OsHAP3F和OsHAP3I的亲缘关系较近。 7.TaNF-YB3基因的表达分析 利用实时定量RT-RCR技术检测TaNF-YB3基因的表达模式,分析结果显示,其mRNA主要积累在叶片中,茎中的表达水平一般,几乎不在根中表达;在幼穗、雌蕊和幼胚的表达水平很低。但在雄蕊中表现出较高水平的表达,而且与茎中的积累几乎相同。而且TaNF-YB3基因还响应不同的非生物胁迫,低温与春化作用相似,均抑制其表达。在LD,TaNF-YB3的表达水平高于SD,但LD中给予一段时间的SD,表达骤然上升,这与LD下插入一段SD、4℃春化处理的结果类似,因为插入的SD和春化期间的表达趋势相近,这说明TaNF-YB3基因优先响应LD。TaNF-YB3基因在冬性小麦LD、SD的节奏性表达间接证实了酵母双杂交的结果,因为其无论LD还是SD条件都与小麦TaVRN2的表达模式一致,尤其是与ZCCT1的更相近,但与CO的模式不一致,这能在生物节律钟的同步性上说明二者互做的可能性。 8.TaNF-YB3基因的过量表达转基因拟南芥在开花时间上无明显影响35S::TaNF-YB3转拟南芥植株在开花时间上与野生型差异不大,但转基因叶片出现不同程度的的卷曲、分裂,严重的长成线状叶。这说明小麦TaNF-YB3基因影响了叶片的正常发育。而且,有的叶片出现黄化现象,甚至在早期真叶刚发育时呈透明针状叶,可能影响了叶绿素基因的合成。鉴于异源转化拟南芥存在种间差异,TaNF-YB3基因在调节开花时间方面的功能,仍需要结合我们的35S::TaNF-YB3转化二穗短柄草Bd21(处于T0代生长状态)的转基因结果进行深入的验证和核实。
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