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《山东农业大学》 2011年
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玉米MAPK基因家族的鉴定及ZmMPK4基因对的功能分析

刘玉鲲  
【摘要】:促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)级联途径是真核生物中广泛存在的信号转导途径。促分裂原活化蛋白激酶级联途径由MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化传递信号。MAPK级联途径各激酶基因家族在不同植物物种中是保守的。目前,玉米基因组测序已经完成,在基因组水平上解析玉米MAPK家族的信息已经成为可能。MAPK是连接底物和上游信号的重要因子。以前的研究表明,MAPK级联途径参与植物的ABA信号转导。但是,关于ABA信号中特异的MAPK基因的研究仍然很有限。 本研究根据植物MAPK基因的保守性鉴定了玉米MAPK家族的基因。对玉米MAPK基因家族的分类、蛋白生化特性、基因结构、染色体分布、蛋白的系统进化以及基因在幼苗根、茎、叶中的表达模式进行了系统分析。在此基础之上,选取了ZmMPK4基因进行功能研究。ZmMPK4为双拷贝基因,和ZmMPK3是基因对,ZmMPK4基因对参与ABA信号转导。主要研究结果如下: (1)利用网络数据库的BLAST和本地Stand-alone BLAST的方法,鉴定了19个玉米MAPK基因。19个MAPK基因的氨基酸长度在369到642之间,分子量在42.199 kDa到72.444 kDa之间,等电点在5.26到9.82之间。6号和8号染色体各有4个MAPK基因,5号和9号各3个,10号2个,1号、3号、4号各1个。与双子叶拟南芥和杨树比较,玉米MAPK基因和水稻MAPK基因的亲缘关系比较近。 (2)ZmMPK1和ZmMPK2的序列高度相似,数据库搜索表明,没有EST序列特异的和ZmMPK1匹配。RT-PCR分析表明,在玉米幼苗根、茎、叶中检测不到ZmMPK1的表达,说明ZmMPK1可能是一个假基因。其它18个基因在玉米幼苗根、茎、叶中都能检测到。除了ZmMPK12、ZmMPK18、ZmMPK19没有明显的组织特异性外,其它15个基因在玉米幼苗根、茎、叶中的分布均不同。 (3)PCR分析表明,ZmMPK4和文献报道的ZmMPK4(命名为ZmMPK4-2)的序列不完全一致。ZmMPK4-2是ZmMPK4的一个可变剪接产物。基因测序和玉米MAPK基因家族的分析表明,ZmMPK4是双拷贝基因,ZmMPK3和ZmMPK4是基因对。Southern实验验证了ZmMPK4的拷贝数。ZmMPK3和ZmMPK4的核苷酸相似度为92.1%,编码氨基酸的相似度为90.0%。ZmMPK3和ZmMPK4分别位于1号染色体短臂和9号染色体长臂。两个基因都能形成mRNA和蛋白质。 (4)序列分析表明,ZmMPK4的3号内含子是GC-AG型内含子。ZmMPK4-2是保留了ZmMPK4的3号内含子形成的可变剪接产物。ZmMPK4-2的组成型表达量非常低,主要在叶中表达。ZmMPK4也可以剪切3号内含子形成正常的ZmMPK4-1,且为ZmMPK4基因表达的主要方式。ZmMPK3的3号内含子为GT-AG型内含子。 (5)Northern杂交实验表明,ZmMPK3主要在生长5日的幼苗叶中表达,ZmMPK4主要在幼苗根中表达。ZmMPK3和ZmMPK4都受ABA(100?M)和NaCl(200mM)的诱导,但诱导时间和表达量不同。但是,Northern杂交不能区分ZmMPK4-1和ZmMPK4-2。利用RT-PCR的方法,进一步分析了ZmMPK4-1和ZmMPK4-2的特异表达,结果显示,ZmMPK4-2主要在叶中表达,即ZmMPK4在幼苗中的可变剪接主要在叶中进行。ZmMPK4的可变剪接受ABA或NaCl的调控。 (6)制备了ZmMPK3的抗体(Anti-ZmMPK3)。因为ZmMPK3和ZmMPK4的氨基酸序列高度相似,无法设计特异抗体。ZmMPK3和ZmMPK4的混合蛋白(约43kDa)在生长5d的玉米叶片中组成型表达,ABA(100?M)可以轻微诱导ZmMPK3和ZmMPK4混合蛋白的表达。免疫沉淀分析表明,ABA可以激活ZmMPK3和ZmMPK4混合蛋白的激酶活性(0.5h和1h)。用烟草叶片瞬时转化法分别检测ZmMPK3、ZmMPK4-1和ZmMPK4-2的活性,检测不到ZmMPK4-2的活性,而ZmMPK3或ZmMPK4-1的激酶活性都可以被ABA诱导。 (7)洋葱表皮表达分析表明,ZmMPK3或ZmMPK4-1的融合蛋白主要定位于细胞膜和细胞核,而ZmMPK4-2融合蛋白主要定位于细胞膜和细胞质。ZmMPK4-2中的30个氨基酸的插入可能影响ZmMPK4的细胞定位。 (8)过表达ZmMPK4-1可以促进拟南芥提前抽薹。在发育后期,转基因拟南芥的主茎上可以形成莲座叶,并可继续抽薹。在正常MS培养基上,过表达ZmMPK4-1的拟南芥和野生型拟南芥的萌发率没有明显差别(约为100%)。0.5?M的ABA可以抑制转基因和野生型拟南芥种子的萌发,但对转基因拟南芥的抑制明显强于野生型。正常生长条件下,ZmMPK4-1在转基因拟南芥中具有激酶活性。ABA(0.5?M)可以增强转基因拟南芥中ZmMPK4-1的激酶活性。过表达ZmMPK4-1可以诱导拟南芥AtACT1的组成型表达,可以增强AtACT2、ABI3、ABI5基因对ABA(0.5?M)的响应。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S513

【引证文献】
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