收藏本站
《山东农业大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究

周波  
【摘要】:纳豆激酶是从日本传统的大豆发酵食品——纳豆中发现的新型纤溶酶。这种酶具有较高的纤溶活性,无毒副作用,不引起内出血,在体内半衰期长。纳豆激酶无论作为抗血栓药物还是预防血栓栓塞性疾病的保健食品,都具有重要的开发价值。天然的纤溶酶活性往往较低,通过利用体外DNA分子改造等基因操作技术,构建高比活力的工程菌是实现产业化的重要途径。 本研究主要进行了以下工作: (1)通过酪蛋白平板初筛和血纤维蛋白平板复筛结合的方法,从豆豉、纳豆样品中筛选到了21株纤溶酶产生菌,获得了一株高产纤溶酶菌株Na-002,纤溶酶活性可达10875U/g,比相关报道的出发菌株活性都要高。 (2)通过形态鉴定、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析等多项分类法,对Na-002进行了鉴定,确定其属于枯草芽孢杆菌。 (3)通过PCR扩增技术,克隆获得了纤溶酶基因,与公布的11株纳豆激酶的核苷酸序列相似性达到99.8%~99.2%,氨基酸序列相似性达到98.6%~99.7%,说明该纤溶酶基因是纳豆激酶系列的一种,该基因的序列保守性强。 (4)通过PCR技术克隆得到pro-NK基因,并分别构建pET-32a(+)表达载体、pWB980表达载体与pPIC9K表达载体,实现了在大肠杆菌BL21(DE3)、枯草芽孢杆菌WB800和毕赤酵母GS115中进行表达。实验表明,大肠杆菌表达的酶蛋白表达量高,易于纯化,但是多以包涵体形式存在,需要通过变性复性的方法才能获得有活性的酶;枯草芽孢杆菌表达活性最好,但是表达量少,纯化难度大;毕赤酵母表达系统的纯度高,但存在活性低,表达量相对较小的缺点。 (5)通过定点突变的方法,从pH稳定性的角度对该酶基因进行了定点突变研究,获得了S182L、S182W、S182K、L203E、L203K等5个突变体,并实现了毕赤酵母表达。通过对该酶最适pH的测定发现,该酶最适pH的变化与碱基替换呈现出相关性:酸性氨基酸有利于酶在pH值为酸性范围内稳定,而碱性氨基酸有利于酶在pH值为碱性范围内稳定。 (6)通过同源建模,推测该酶具有两个结构域:结合结构域(CBM)和催化结构域(CD)。CBM是结合在底物表面的,位于N端,用1scjB(同源性97.183%)作为模板,构建CBM的三维结构,它是由第7个氨基酸到第77个氨基酸共71个氨基酸构成,形成了两个α螺旋和3个β折叠;CD的三维结构用1scjA (同源性98.545%)作为模板来构建,由第78个氨基酸到第352个氨基酸共275个氨基酸构成,形成了一个(β/α)7桶状结构。 本研究丰富了纳豆激酶的酶学基础理论知识,并为进一步的基因水平酶分子进化理论的研究以及口服溶栓药物的开发和应用奠定了基础。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q936;Q78

手机知网App
【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 王菲;蛋清源抗凝血肽分离纯化及活性鉴定[D];吉林大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张丽萍;血栓形成及抗血栓药物研究的进展[J];心功能杂志;1998年01期
2 陈蓉,谢梅林;新型抗血栓药物作用机制研究进展[J];中国药理学通报;2004年08期
3 阎家麒,童岩,臧莹安;豆豉纤溶酶的纯化及其性质研究[J];药物生物技术;2000年03期
4 郭怀芳,何执中,张莉;蚓激酶的临床应用进展[J];药物生物技术;2002年01期
5 吴梧桐;蛋白质工程技术与新型生物催化剂设计[J];药物生物技术;2004年01期
6 王敏,王骏,邵明远,王敏,王以光;链霉菌产生的新型纤溶酶的纤溶性质和溶栓作用[J];药学学报;1998年07期
7 彭勇,张义正;解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达[J];应用与环境生物学报;2002年03期
8 王鸿利;抗血栓药物的血液学原理[J];中国处方药;2004年01期
9 邹和昌;溶栓剂的发展及研究[J];中国药学杂志;1997年05期
10 李家增;溶血栓药的作用机制[J];中华医学杂志;2004年11期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 张秀艳;β-葡聚糖酶的定向进化及热稳定性研究[D];浙江大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 徐天鹏;里氏木霉纤维素酶基因的克隆及其在毕赤酵母中表达的研究[D];东北农业大学;2007年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 闫杰,李鑫,何忠平,宋淑静,戴旺苏;血清乙肝病毒DNA煮沸抽提法的建立和应用[J];胃肠病学和肝病学杂志;2003年04期
2 张汝钢,房殿春,闫秀英,罗元辉,帖君;hTERT干扰真核表达载体的构建及鉴定[J];胃肠病学和肝病学杂志;2005年05期
3 徐宏勇;徐立;李开宗;;一种新型胃肠道癌特异性单链抗体的表达及其在胃癌中的检测[J];胃肠病学和肝病学杂志;2011年08期
4 胡燕,孟小林,徐进平,张俊杰,王健,鲁伟;蚯蚓纤溶酶基因的cDNA克隆及其序列分析[J];武汉大学学报(理学版);2004年02期
5 周灵德;闫玉华;袁琳;李世普;;大鼠骨粘连蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化[J];武汉理工大学学报;2008年05期
6 向梅,杨金树,吴思方;豆豉纤溶酶的研究进展[J];武汉工业学院学报;2002年04期
7 李志红,林伟,孙京臣,杨艺峰,张景强;SARS冠状病毒N蛋白的表达及二级结构预测分析[J];三峡大学学报(自然科学版);2005年01期
8 罗锋;余腾;范丽梅;;感受态细胞制备和质粒转化冰浴时间对大肠埃希菌转化效率的影响[J];江汉大学学报(自然科学版);2011年03期
9 曹侃;;p53蛋白对HL-60肿瘤细胞凋亡率的影响[J];芜湖职业技术学院学报;2008年01期
10 周世力;PCR技术原理及在法医学中的应用[J];武汉教育学院学报;1999年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 朱林;江昌俊;叶爱华;李叶云;余梅;邓威威;;茶树ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基转移酶基因植物表达载体的构建[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年
2 邓露芳;王加启;姜艳美;卜登攀;魏宏阳;周凌云;王金枝;;产气法评价纳豆芽孢杆菌对瘤胃液体外发酵的影响[A];第三届中国奶牛发展大会论文集[C];2008年
3 徐波;张莉;李启云;王景会;姜媛媛;杨贞耐;;牛凝乳酶成熟肽基因在大肠杆菌中的表达[A];中国奶业协会年会论文集2008(下册)[C];2008年
4 季红;吴正钧;陆孝义;;纤溶酶研究进展及以此为借鉴的乳源抗凝肽研究展望[A];中国奶业协会年会论文集2008(下册)[C];2008年
5 刘冬光;廖娟红;于清龙;陈颖钰;陈焕春;郭爱珍;;融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用[A];中国奶业协会年会论文集2009(上册)[C];2009年
6 孙妍;王加启;奚晓琦;卜登攀;魏宏阳;周凌云;;产蛋白酶和纤维素酶纳豆芽孢杆菌益生菌株的筛选及其生长特性研究[A];首届中国奶业大会论文集(上册)[C];2010年
7 张海龙;田兆丰;董志;张晏如;张飞云;;多花黑麦草斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达[A];2010植物免疫机制研究及其调控研讨会论文集[C];2010年
8 闫云君;蔡勇;杨江科;;基于易错POR技术的短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)脂肪酶YZO2的定向进化[A];节能环保 和谐发展——2007中国科协年会论文集(一)[C];2007年
9 李玫;廖宝文;;红树林湿地烷烃降解菌的分离筛选[A];第十三届中国科协年会第16分会场-沿海生态建设与城乡人居环境学术研讨会论文集[C];2011年
10 孙婕;刘宁;;纳豆的保健功效与人类健康[A];食物功效成分与健康——达能营养中心第九次学术年会会议论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
2 殷慧群;猪诱导性多潜能干细胞的建立[D];安徽农业大学;2010年
3 郭宪;抑制素基因工程疫苗的研究与应用[D];甘肃农业大学;2010年
4 杨瑞梅;单链抗体介导狂犬病毒shRNA靶向制剂的研究[D];甘肃农业大学;2010年
5 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
6 郭新军;拟黑多刺蚁肌细胞增强因子2与肌钙蛋白Ⅰ亚基基因的克隆及其在发育中的表达研究[D];陕西师范大学;2010年
7 生书晶;何首乌芪合酶基因(FmSTS)的克隆、鉴定及转化拟南芥研究[D];华南理工大学;2010年
8 张少平;豆豉纤溶酶定向进化及突变酶基因的表达研究[D];华南理工大学;2010年
9 高卫华;芽孢杆菌胞外蛋白酶合成及抑菌功能的调控机制研究[D];南开大学;2010年
10 梁东;苹果山梨醇代谢相关基因的分子特性研究[D];西北农林科技大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高红梅;ETEC对断奶腹泻仔猪胃肠道紧密连接蛋白ZO-1的影响[D];华中农业大学;2010年
2 王树云;斑点叉尾鮰病毒ORF6和ORF10基因的原核表达及其功能的初步研究[D];华中农业大学;2010年
3 汪艳杰;水稻polycomb基因家族甲基化状态初步检测[D];华中农业大学;2010年
4 王伟;恶臭假单胞菌表面展示细菌漆酶及对染料的脱色性能[D];华中农业大学;2010年
5 黄辉;哈维弧菌表面抗原的克隆和真核表达[D];华中农业大学;2010年
6 段龙川;产毒素多杀性巴氏杆菌重组沙门氏菌基因工程疫苗的研究[D];华中农业大学;2010年
7 龚瑞;粘附素ClfA和Cna对金黄色葡萄球菌乳腺炎的免疫保护研究[D];华中农业大学;2010年
8 刘源;猪胸膜肺炎放线杆菌双组分调控系统ΔnarQ/narP突变株构建及功能研究[D];华中农业大学;2010年
9 杨兆光;棉花航天诱变芽黄突变体中棉所58Vsp的遗传及基因表达差异分析[D];华中农业大学;2010年
10 李善文;蟾蜍灵对大鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡的影响[D];南京医科大学;2009年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 彭继明;张佑红;徐鹏;陈林;马静;危威;;不同pH值条件下的丝氨酸标准曲线[J];武汉工程大学学报;2010年03期
2 孙勤;陈季旺;夏文水;舒静;;食品蛋白源ACE抑制肽的生理和生化性质[J];武汉工业学院学报;2009年01期
3 万菡;刘良忠;李丁宁;刘培勇;;碱性蛋白酶对鸡蛋清的酶解效果研究[J];武汉工业学院学报;2011年03期
4 许俊堂,胡大一,吴立玲,刘乃奎,郑新程;大鼠主动脉拉伤模型血管壁凝血酶活性的观察[J];微循环学杂志;2003年02期
5 田垒;霍建丽;王卫国;徐红岩;孔毅;;新的抗凝血三肽及其改造物的合成和生物活性[J];西北药学杂志;2009年03期
6 帅行明;姜伟;;蛋白质提纯和结构鉴定研究进展[J];信阳农业高等专科学校学报;2007年03期
7 李素华;刘希龙;佟凤芝;;急性脑梗死患者血浆AT-Ⅲ活性变化及临床意义[J];中国医疗前沿;2010年06期
8 李华;陈陵霞;许瑞安;;纤溶活性的药学测定方法研究[J];中国临床药理学与治疗学;2008年09期
9 祁静;;溶菌酶的紫外分光光度法检测[J];仪器仪表与分析监测;2006年02期
10 方婕;;止血药凝血酶的研究进展[J];医学信息(中旬刊);2011年06期
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 王冰;降解丝素放线菌的分离鉴定、发酵条件优化及其降解机制研究[D];山东农业大学;2009年
2 黎渊弘;短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的生物化学、药理学和分子生物学的研究[D];广西医科大学;2007年
3 张媛媛;用于内毒素去除的新型亲和吸附剂的制备及性能研究[D];复旦大学;2007年
4 杨万根;蛋清蛋白水解物的制备、结构及其生物活性的研究[D];江南大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 任琦;磁性复合微球的制备及其在蛋白吸附中的应用[D];江南大学;2011年
2 侯欣欣;毒死蜱和TCP对斑马鱼DNA损伤及氧化胁迫[D];山东农业大学;2011年
3 屈春花;样品前处理技术结合高效液相色谱在食品安全检验中的应用研究[D];西南大学;2011年
4 章小忠;纤维素硫酸钠制备工艺的放大和产纳豆激酶枯草杆菌微胶囊培养研究[D];浙江大学;2003年
5 张建荣;新型壳聚糖衍生物抗凝血材料[D];天津大学;2004年
6 徐义刚;中国林蛙皮肤活性肽分离提取的研究[D];东北林业大学;2004年
7 李方;涤纶材料表面改性及其抗凝血性能研究[D];西南交通大学;2005年
8 武国栋;白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的分离纯化及酶学表征[D];大连理工大学;2006年
9 王立晖;胃蛋白酶酶解酪蛋白制备酪啡肽的研究[D];西华大学;2006年
10 刘志国;凝血检查在肝病诊治临床价值的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
【二级引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 安晓宁;长白山特产鸡蛋中类胡萝卜素的分离鉴定及稳定性研究[D];吉林大学;2013年
2 王冬娇;池沼公鱼抗凝活性成分的分离、纯化[D];吉林农业大学;2013年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 罗明典;微生物制药研究新进展[J];微生物学通报;1998年01期
2 许杨,孙红斌,谢俊杰;细菌素作为生物防腐剂的研究现状[J];微生物学通报;1998年02期
3 肖志壮,王婷,王攀,曲音波,高培基;筛选在非生长条件下突变体酶的新方法[J];微生物学通报;2001年05期
4 郝志军,李忠兴;青霉NXP25纤维素酶的产生及性质[J];微生物学通报;2002年01期
5 韩雪清,刘湘涛,尹双辉;毕赤酵母表达系统[J];微生物学杂志;2003年04期
6 王黎明,王琦,梅汝鸿;巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展[J];微生物学杂志;2004年02期
7 冯清平,薛林贵;复合诱变原生质体选育耐热碱性蛋白酶高产菌[J];微生物学报;1996年06期
8 罗大珍,朱文,马继霞,王宇钢,赵渭江;离子注入右旋糖酐生产菌的诱变效应研究[J];微生物学报;1997年04期
9 肖志壮,王婷,汪天虹,曲音波,高培基;瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅲ基因的克隆及在酿酒酵母中的表达[J];微生物学报;2001年04期
10 孙建义,李卫芬,顾赛红;木霉GXC产β-葡聚糖酶条件和酶学性质[J];微生物学报;2001年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈坚,张晓琴,傅继梁;3个HDAC1的保守氨基酸定点突变的获得[J];癌变畸变突变;2000年02期
2 曾琦锴;杜红丽;翟志臣;林小琼;林影;;Lysine 21突变对树干毕赤氏酵母木糖还原酶辅酶依赖性的影响[J];生物工程学报;2008年06期
3 郭冬林,唐伟,江雪源,徐贤秀;第20位脯氨酸对人肿瘤坏死因子的活性和结构的作用[J];生物化学与生物物理学报;1994年04期
4 张浩,毛秉智,王全立,冯起,杜芝燕,刘晓达;PCR定点突变血红蛋白基因的克隆和筛选[J];生物学杂志;1999年06期
5 苏智广,张思仲,夏庆杰,肖翠英;脂蛋白脂酶基因的克隆、序列测定及定点突变[J];中国生物化学与分子生物学报;2001年06期
6 王宇新;杨志新;朱恒奇;周晓巍;黄培堂;;IL-1ra突变体的构建、表达及初步的药代动力学分析[J];生物工程学报;2006年03期
7 郭小兵;张志坚;张钦宪;;PCR介导的ret基因体外定点突变[J];郑州大学学报(医学版);2007年01期
8 谷维娜;杨培龙;王亚茹;罗会颖;孟昆;伍宁丰;姚斌;范云六;;Aspergillus fumigatus来源植酸酶的Q23L和Q23LG272E突变研究[J];生物工程学报;2007年02期
9 姚庆荣;郭运玲;孔华;张金文;郭安平;贺立卡;刘恩平;;大肠杆菌glgC基因的定点突变及高效表达[J];热带作物学报;2007年01期
10 王青艳;陈发忠;黄福宝;韦传东;韦宇拓;黄日波;;Thermobifida fusca海藻糖合成酶的定点突变及其动力学性质研究[J];广西农业生物科学;2007年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 杜红丽;王靖方;魏冬青;林影;;热带假丝酵母木糖醇脱氢酶定点突变设计的生物信息学分析[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
2 赵晗;卢丽丽;范树泉;肖敏;;短双歧杆菌α-半乳糖苷酶Aga2催化位点定点突变研究[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
3 牛静宜;王晔;陈鹏;王宜强;;重叠区扩增基因拼接法定点突变TGFBI及其真核表达载体的构建[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
4 王玉炯;许崇波;曾瑾;马春燕;李芳;;产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆及定点突变[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
5 柳广飞;周集体;王竞;吕红;金若非;;偶氮还原酶AZR的结构与定点突变研究[A];第十次全国环境微生物学术研讨会论文摘要集[C];2007年
6 牛聪伟;孙璐;张楠;席真;;双点突变乙酰羟基酸合成酶(AHAS)的基因表达及其酶与除草剂的相互作用[A];第五届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2007年
7 迟灵芝;刘茂军;冯志新;单虎;邵国青;;猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集[C];2008年
8 单虎;秦晓冰;黄娟;张莉平;迟灵芝;;猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
9 王建林;陈思礼;赵开弘;;集胞藻PCC 6803 apcD基因的定点突变及体内重组研究[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年
10 费俭;王敏;林庆聪;张懋弧;陈霞;蔡国强;;用定点突变的方法研究青霉素G酰化酶的结构与功能[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 何国庆 张灏;新酶种的开发和酶性能的改善(下)[N];中国食品报;2009年
2 本报记者 赵笛;沙珍霞:揭开鱼类基因之谜[N];青岛日报;2011年
3 记者 杨金志;我国科学家揭示药物治疗牛皮癣的分子基础[N];经济参考报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周波;枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究[D];山东农业大学;2011年
2 王华;定点突变β-环糊精葡萄糖基转移酶及其突变菌株发酵条件优化[D];吉林农业大学;2012年
3 王会征;一种与聚羟基脂肪酸酯生物合成相关的新型水合酶结构生物学研究[D];山东农业大学;2013年
4 刘艳;嗜热丝氨酸蛋白酶TfpA的外源表达与分子定向改造[D];四川农业大学;2012年
5 李艳;嗜麦芽窄食单胞菌L1、L2两种β内酰胺酶研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
6 鲍文娜;Bordetella sp.BK-52顺式环氧琥珀酸水解酶催化作用的分子机制研究[D];浙江大学;2013年
7 杨建强;革耳(Panus rudis)漆酶的异源表达和酶学性质改良[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
8 高平挥;白念珠菌多药耐药蛋白Cdr1p构效关系研究[D];第二军医大学;2006年
9 董慧;叶绿体ATP合酶的活性调节与亚基的定点突变[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2005年
10 郭勤;海参精氨酸激酶的折叠与结构研究[D];清华大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨欣;深海细菌Geobacillus stearothermophilus TH10中嗜热脂肪酶的表达鉴定及体外诱变研究[D];厦门大学;2009年
2 杨登峰;新型甘油脱水酶同源基因的克隆、表达及其理性设计[D];广西大学;2005年
3 管海宏;天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的多反应性鉴定及其分子机制的初步探讨[D];第四军医大学;2005年
4 陈木妹;扩展青霉脂肪酶的定点突变[D];福建师范大学;2005年
5 吴倩倩;琼胶酶β-AgaA结构和功能关系的研究[D];中国海洋大学;2008年
6 肖志广;鸡Mx基因的克隆及其抗AIV活性的研究[D];中国农业科学院;2011年
7 陈国仁;扩展青霉脂肪酶的定点突变及随机突变[D];福建师范大学;2005年
8 郭娟娟;B10位突变对提高重组人胰岛素基因在糖尿病大鼠体内表达效率的研究[D];中国医科大学;2006年
9 李晨;一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性[D];山西大学;2006年
10 张洪喜;纤维素酶的定向进化、定点诱变及耐碱机理研究[D];山东大学;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026