枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究

【摘要】：纳豆激酶是从日本传统的大豆发酵食品——纳豆中发现的新型纤溶酶。这种酶具有较高的纤溶活性，无毒副作用，不引起内出血，在体内半衰期长。纳豆激酶无论作为抗血栓药物还是预防血栓栓塞性疾病的保健食品，都具有重要的开发价值。天然的纤溶酶活性往往较低，通过利用体外DNA分子改造等基因操作技术，构建高比活力的工程菌是实现产业化的重要途径。 本研究主要进行了以下工作： （1）通过酪蛋白平板初筛和血纤维蛋白平板复筛结合的方法，从豆豉、纳豆样品中筛选到了21株纤溶酶产生菌，获得了一株高产纤溶酶菌株Na-002，纤溶酶活性可达10875U/g，比相关报道的出发菌株活性都要高。 （2）通过形态鉴定、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析等多项分类法，对Na-002进行了鉴定，确定其属于枯草芽孢杆菌。 （3）通过PCR扩增技术，克隆获得了纤溶酶基因，与公布的11株纳豆激酶的核苷酸序列相似性达到99.8%~99.2%，氨基酸序列相似性达到98.6%~99.7%，说明该纤溶酶基因是纳豆激酶系列的一种，该基因的序列保守性强。 （4）通过PCR技术克隆得到pro-NK基因，并分别构建pET-32a(+)表达载体、pWB980表达载体与pPIC9K表达载体，实现了在大肠杆菌BL21（DE3）、枯草芽孢杆菌WB800和毕赤酵母GS115中进行表达。实验表明，大肠杆菌表达的酶蛋白表达量高，易于纯化，但是多以包涵体形式存在，需要通过变性复性的方法才能获得有活性的酶；枯草芽孢杆菌表达活性最好，但是表达量少，纯化难度大；毕赤酵母表达系统的纯度高，但存在活性低，表达量相对较小的缺点。 （5）通过定点突变的方法，从pH稳定性的角度对该酶基因进行了定点突变研究，获得了S182L、S182W、S182K、L203E、L203K等5个突变体，并实现了毕赤酵母表达。通过对该酶最适pH的测定发现，该酶最适pH的变化与碱基替换呈现出相关性：酸性氨基酸有利于酶在pH值为酸性范围内稳定，而碱性氨基酸有利于酶在pH值为碱性范围内稳定。 （6）通过同源建模，推测该酶具有两个结构域：结合结构域（CBM）和催化结构域（CD）。CBM是结合在底物表面的，位于N端，用1scjB（同源性97.183%）作为模板，构建CBM的三维结构，它是由第7个氨基酸到第77个氨基酸共71个氨基酸构成，形成了两个α螺旋和3个β折叠；CD的三维结构用1scjA (同源性98.545%)作为模板来构建,由第78个氨基酸到第352个氨基酸共275个氨基酸构成，形成了一个(β/α)7桶状结构。 本研究丰富了纳豆激酶的酶学基础理论知识，并为进一步的基因水平酶分子进化理论的研究以及口服溶栓药物的开发和应用奠定了基础。

【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：Q936;Q78