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《山东农业大学》 2011年
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黄伞子实体多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性的研究

聂永心  
【摘要】:黄伞(Pholiota adipose (Fr.) Quel),又名柳蘑、黄蘑、多脂鳞伞,属于层菌纲,伞菌目,球盖菇科,鳞伞属,是一种具备较高研究开发价值的食药用真菌。黄伞子实体不仅菇质脆嫩,味道鲜美,营养丰富,而且其多糖具有调节机体免疫力、抗肿瘤、降血脂、抗菌、抗氧化、抗衰老等多方面的生物活性。目前为止,关于黄伞的研究大多集中在多糖提取工艺和粗多糖活性分析等方面,对黄伞子实体多糖的纯化、结构和纯化多糖级分活性的研究还未见有报道。本研究以黄伞子实体为试材,对其多糖的分离纯化、结构鉴定及体外抗氧化活性等方面进行了较系统的研究,对开发利用我国珍贵的药用真菌资源具有重要的学术意义,对开发天然抗氧化剂也具有一定的实用价值。研究结果如下: 1.黄伞子实体多糖提取工艺研究 通过单因素试验和正交试验,确定了水提醇沉法提取黄伞子实体多糖较佳的提取工艺,提取温度为100℃,时间4h,水料比为20:1v/w,浸提次数1次,此工艺下黄伞子实体多糖的得率高达8.19%。 2.黄伞子实体多糖分离纯化研究 黄伞子实体多糖通过脱蛋白、脱色、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析和superdex~(TM)200凝胶柱层析分离纯化,得到3个黄伞子实体多糖组分(PAP1-1、PAP1-2和PAP2-1),经紫外扫描和HPSEC分析,3种多糖组分为基本不含蛋白和核酸的均一组分,纯度分别为97.23%、98.85%和98.91%。 3.多糖单糖组成检测方法的建立 (1)糖腈乙酰酯衍生化气相色谱法 色谱条件:DB-23石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm),FID检测器,检测器温度250℃,进样口温度250℃,柱温220℃;进样量0.5μL,柱流量1.0mL/min,分流比20:1,在20min内实现了8种单糖的分离; (2)非衍生化HPLC-ELSD法 色谱条件:Prevail Carbohydrate ES Column(4.6mm×250mm, 5μm),柱温25℃;流动相为乙腈-水(85:15),流速0.8mL/min;ELSD检测器温度80℃,辅助气(N2)压力3.5bar,增益(gain)为6,在35min中内实现了葡萄糖醛酸和6种单糖的分离。 4.黄伞子实体均一多糖组分的结构分析通过HPSEC、GC、HPLC-ELSD、IR和NMR(1H NMR和13C NMR)等方法,初步鉴定了黄伞子实体均一多糖的化学结构。 (1)PAP1-1分子量约为2.3×10~6Da,由α-D吡喃葡萄糖残基组成的葡聚糖,基本不含糖醛酸,多糖主链由1-4和1-6糖苷键连接; (2)PAP1-2分子量约为8.8×10~3Da,由D-吡喃葡萄糖和鼠李糖组成,摩尔比为3.55:1,基本不含糖醛酸,可能同时含有α和β型糖苷键,主链由1-6糖苷键连接; (3)PAP2-1分子量约为2.1×10~6Da,由α-D吡喃葡萄糖残基组成的葡聚糖,基本不含糖醛酸,多糖主链由1-4和1-6糖苷键连接。 5.黄伞子实体多糖的生物活性分析 (1)通过观察提取纯化的黄伞子实体多糖(PAP)对小鼠腹腔巨噬细胞的(PEMΦ)激活效应,结果表明黄伞子实体多糖能有效地激活巨噬细胞,通过增强细胞因IL-1β子分泌、增强NO的产生水平、增强其吞噬功能及体外杀伤活性等多种途经来调节免疫系统,并可起到抑制肿瘤的生长的效应; (2)黄伞子实体多糖(PAP)灌胃给药,对小鼠S180实体瘤有一定的抑瘤作用,且呈现剂量效应关系,灌胃剂量为1.5mg/kg·d时,抑瘤率为38.46%; (3)通过密闭缺氧实验发现不同剂量的黄伞子实体多糖(PAP)均能不同程度地延长小鼠在密闭条件下的存活时间,其中以3.0mg/kg·d效果最好,存活时间比对照组延长了38.9%; (4)通过检测PAP、PAP1-1、PAP1-2和PAP2-1对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力,对黄伞子实体多糖的体外抗氧化活性进行了研究,并与阳性对照抗坏血酸(Vc)进行比较。结果表明,PAP对三种自由基都表现出了一定的清楚能力,而且清除DPPH自由基的能力高于三种纯化多糖组分,PAP1-1对超氧阴离子自由基和羟基自由基表现出了较强的清除能力,尤其是对羟基自由基的清除能力接近于Vc,有可能开发为新型的抗氧化剂。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S567.39;S646.1

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【引证文献】
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