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《山东农业大学》 2012年
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辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)阿魏酸酯酶基因克隆及其致病功能分析

武琼  
【摘要】:辣椒疫病(pepper blight)是辣椒的主要病害之一,病原为辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian).阿魏酸酯酶作为微生物细胞壁降解酶的一部分,在致病过程中的作用越来越受到重视。本文初步研究了辣椒疫霉中阿魏酸酯酶的功能和在致病过程中的作用,研究结果如下: (1)辣椒疫霉菌株SD33内PcFAE基因克隆、序列比对及系统进化分析。本研究从辣椒疫霉基因组DNA中筛选并成功克隆到两个基因,分别命名为PcFAEl和PcFAE2,都含有一个典型的阿魏酸酯酶基序-GXSXG-,以及一个保守的鞣酸酶和阿魏酸酯酶结构域,初步证明其为编码阿魏酸酯酶的基因。生物信息学分析显示,两个基因都含有信号肽和糖基化位点。序列比对发现该基因在卵菌中是高度保守的,系统进化分析揭示卵菌同真菌的亲缘关系较远。 (2)辣椒疫霉PcFAE1和PcFAE2基因在不同发育阶段和侵染不同时期的表达模式分析。通过荧光定量PCR的方法初步分析了PcFAE基因分别在菌丝、产孢菌丝、游动孢子、休止孢、休止孢萌发阶段和受侵染后12h、24h、36h、48h和72h的辣椒叶片各阶段样品的中的表达水平,结果显示PcFAE基因主要在菌丝、孢子囊阶段和侵染后期特异表达,在辣椒疫霉侵染寄主的过程中起到了重要作用。 (3)辣椒疫霉PcFAE1和PcFAE2基因在植物体内的功能分析。利用农杆菌侵染法分别接种烟草和辣椒叶片产生了不同程度的症状,证明辣椒疫霉PcFAE基因植物体内能够表达并且对不同的寄主具有选择性。 (4)辣椒疫霉PcFAEl和PcFAE2基因在菌体内的稳定沉默和过量表达。通过PEG介导的原生质体共转化技术分别获得基因沉默和过量表达转化子,再通过RT-PCR和荧光定量PCR进一步验证。 (5)对转化子进行生物表型分析和致病性测定。分析结果发现各转化子在大部分生物表型方面与野生型菌株无显著差异,但沉默转化子产孢子囊、游动孢子和阿魏酸酯酶的能力下降,过量表达转化子产阿魏酸酯酶的能力则提高。致病性检测表明,沉默和过表达后致病力均受到明显影响,与对照相比分别降低和提高。这表明PcFAE基因可能主要在孢子囊、游动孢子阶段和侵染过程中起到重要作用。 通过以上研究初步分析阿魏酸酯酶这一细胞壁降解酶的功能和侵染过程中的作用,有助于从分子水平上了解疫霉菌的致病过程,对于了解疫霉菌发育的分子生物学和致病性具有重要意义,为以后的研究提供依据和参考。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S436.418

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