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拟南芥microRNA启动子甲基化的分析以及AtWRKY30转录因子的生物学功能研究

段丽君  
【摘要】:随着遗传学的发展,表观遗传学(Epigenetics)作为研究表观遗传变异的重要遗传学分支学科,近年来成为研究的主要热点。目前,表观遗传学的研究主要集中在DNA甲基化修饰、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等方面。DNA甲基化广泛存在于原核生物以及真核生物中,并且在生命有机体正常生长发育过程中发挥重要的调控作用。MicroRNA(miRNA)是在真核生物中发现的一类内源的具有调控功能的非编码小RNA,可通过与靶mRNA的互补在转录后水平或翻译水平上介导靶基因的沉默,在动植物的生长发育方面也发挥着重要的作用。 WRKY转录因子超级家族是植物特有的转录因子家族。WRKY转录因子在N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列,它能够与靶基因启动子区域W-盒中的(T)(T)TGAC(C/T)序列发生特异性作用,调控靶基因的表达,从而参与植物的各种防卫反应,调节植物的生长发育等。 在模式植物拟南芥中,我们对miRNA启动子区域甲基化以及WRKY30的生物学功能进行了分析。 (1)通过Anno-J软件分析得出,拟南芥中在启动子区域甲基化修饰的miRNA有15个。利用重亚硫酸氢盐测序法分析得出,miRNA156e、miRNA396a、miRNA399c和miRNA399f启动子区域均存在CpG、CpHpG和CpHpH形式的甲基化修饰。MiRNA396a启动子区域胞嘧啶甲基化修饰水平较高,其他几个miRNAs启动子区域甲基化修饰水平较低。 (2)与野生型相比,在甲基化酶突变体中miRNA396a的表达量明显升高,其靶基因bHLH74和GRF5的表达量下调,说明miRNA启动子甲基化修饰的改变影响miRNA的转录表达。 (3)在4C、甘露醇和NaCl诱导下,miRNA396a启动子区域甲基化修饰水平降低,通过qRT-PCR检测miRNA396a内源表达量升高,并且miRNA396a靶基因的表达量降低。揭示了在外界胁迫条件下,miRNA396a可通过改变启动子区域甲基化修饰水平调节自身的表达,这可能与RNA介导的DNA甲基化机制有关。 (4)通过GUS组织化学染色分析表明,AtWRKY30主要在拟南芥叶片中表达,在花和果荚中有少量表达,暗示WRKY30可能在植物生长发育中发挥重要作用。 (5)AtWRKY30RNAi植株表现出对盐胁迫的敏感性,超表达植株对盐胁迫有一定的耐受性。在ABA处理条件下,AtWRKY30RNAi植株也表现出对ABA的敏感性。表明WRKY30可能通过调节ABA信号途径参与到拟南芥响应盐胁迫的过程中。 (6)WRKY30参与了植物激素类信号调节路径。在ABA和MeJA处理下,AtWRKYRNAi植株种子萌发率明显低于野生型种子萌发率。而将正常生长一周大的幼苗移栽到含有ABA和MeJA的平板上继续生长两周,AtWRKYRNAi植株未表现出敏感表型,表明WRKY30参与了种子萌发阶段植物激素类信号调节途径中。


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