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《山东农业大学》 2013年
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B亚群禽白血病病毒灭活疫苗的制备及免疫保护试验

李薛  
【摘要】:禽白血病是引起禽类产生肿瘤的主要疫病之一,其病原是反转录病毒科α反转录病毒属的禽白血病病毒(Avain leukosis virus,ALV)。根据病毒囊膜糖蛋白的抗原结构、病毒宿主范围及在细胞培养上不同毒株之间的相互干扰作用,将ALV分为A~J10个亚群,其中A、B、C、D、E和J6个亚群存在于鸡群中。A、B和J亚群为鸡群中引发肿瘤的主要外源性ALV,而在鸡群中较少见由C、D亚群外源性ALV引发的肿瘤,E亚群病毒为内源性白血病病毒,对鸡的致病性很低或无致病。在上个世纪80年代以前,A、B亚群ALV是引起鸡群淋巴性白血病和各种类型肿瘤的两类病毒,但在80年代中期,国际大型种鸡公司已基本消除了鸡群中A、B亚型ALV的感染。由于近几十年来我国从未在全国范围内进行对经典ALV的净化措施,我国鸡群特别是地方品系中极可能存在外源性ALV的感染。朱美珍等在山东某地方品系分离到一株A亚群禽白血病病毒,赵冬敏等在我国地方品系芦花鸡中分离到B亚群禽白血病病毒,说明我国鸡群中存在A、B亚群禽白血病病毒的感染。 为加快B亚群禽白血病的净化,本实验成功制备了B亚群禽白血病病毒SDAU09C2株的灭活疫苗,尝试从核心种鸡群疫苗免疫的途径来减少核心种鸡群的带毒率,提高其特异性抗体水平,从而保护其免受禽白血病病毒的感染,同时通过种蛋为下一代提供母源抗体,有效预防或减缓了雏鸡的早期感染,加快禽白血病的净化进程。 要制备高质量的灭活疫苗,必须保证抗原的含量,因此我们首先探索B亚群禽白血病病毒SDAU09C2株的细胞培养的最优条件。将B亚群禽白血病病毒SDAU09C2株接种到对数生长期CEF细胞的12孔细胞培养板上中,孵育2h后,用含不同浓度初生牛血清(0.5%,1%,2%,3%)的DMEM培养液维持10天,每天每板每孔收集150ul细胞上清于1.5ml离心管中,用于p27抗原检测,从而确定维持液最适血清浓度。然后再将SDAU09C2接种到对数生长期CEF细胞的24孔细胞培养板上中,孵育2h后,用不同PH值(6.6~7.7)含0.5%的初生牛血清的DMEM培养液维持10天,每天每板每孔收集150ul细胞上清于1.5ml离心管中,用于p27抗原检测,从而确定维持液最适PH值。最后将SDAU09C2株接种到对数生长期CEF细胞的细胞瓶中,接种2h后,用含PH为6.8,0.5%初生牛血清的DMEM培养液维持10天,每天每瓶各收集2个1.5ml离心管,每管150ul(一管用于p27抗原检测,一管用于TCID50滴度的测定),从而确定p27和TCID50的关系。每次收集上清样品后补充等量的新鲜培养基。通过病毒连续细胞培养检测,发现病毒在PH为6.8,初生牛血清浓度为0.5%的维持液状态下,维持5天,复制出的病毒量最大而且p27和TCID50间显著正相关。 将SDAU09C2接种于20瓶新长成的单层CEF上,在培养瓶中盲传3代后,用PH=6.8小牛血清浓度为0.5%的维持液维持5天,收集带毒细胞,将收集的带毒细胞用PBS稀释至5ml,用体积比为0.2%的甲醛,在37℃培养箱内作用24小时,将灭活的细胞与MONTANIDE ISA775VG(佐剂)体积比为2.6:7.4进行充分乳化,制备出ALV-B灭活疫苗。 9只成年祖代鸡多点注射制备的灭活疫苗1ml(约含病毒106.8个TCID50),未注射疫苗9只成年祖代鸡作为对照。在免疫过的成年产蛋鸡抗体水平最高时,分别从免疫组和未免疫组随机抽取4只免疫过的成年鸡和4只未免疫成年鸡进行攻毒,肌肉多点注射SDAU09C21ml(TCID50为104.6/0.1ml),每周采集抗凝血、非抗凝血、棉拭子进行跟踪检测。剩余5只成年鸡经过四次免疫,每周采集非抗凝血0.5ml,进行抗体检测跟踪。结果表明,免疫该疫苗后,在第三次免疫后的第三周抗体水平最高,S/P在1.69~1.89之间,阳性约维持四周。攻毒后的祖代鸡不论是免疫组还是对照组棉拭子p27全是阴性,也未出现病毒血症,说明成年鸡能够抵抗禽白血病病毒的感染,但对照组的S/P值比免疫组要高一些。免疫组的祖代鸡再次感染该病毒时,与对照组相比能够增强其免疫反应抗体水平更高。 在免疫过的祖代鸡抗体水平最高时收集种蛋(包括无抗体对照组)进行孵化,孵出雏鸡33只,其中有抗体鸡的种蛋孵出的雏鸡17只,无抗体鸡的种蛋孵出的雏鸡16只。将雏鸡分为四组,一组为有抗体鸡的种蛋孵出的14只小鸡,1日龄腹腔攻毒;二组为确定含母源抗体雏鸡3只,腹腔注射PBS(目的是看母源抗体消长规律);三组为无抗体鸡的种蛋孵出的13只雏鸡,1日龄腹腔攻毒;四组为无抗体鸡的种蛋孵出的3只雏鸡,腹腔注射PBS,作为对照。每周采抗凝血、非抗凝血、棉拭子进行跟踪检测。结果显示:母源抗体的消长规律:3只含母源抗体鸡通过连续抗体ELISA检测可知,母源抗体能持续一周左右。含母源抗体组攻毒后,仅有1只鸡在十四周出现抗体反应,而不含母源抗体组攻毒后,因早期感染产生严重的免疫耐受,从而一直未出现抗体阳性。含母源抗体组的12只雏鸡攻毒后,只有4只在第9~10周泄殖腔棉拭子P27出现短暂阳性,最多持续2~3周左右,且S/P值均不高;不含母源抗体组的9只雏鸡攻毒后,在第2~6周后全部出现棉拭子排毒阳性,持续约8~9周左右,且S/P值均显著高于阳性最低值。无母源抗体9只鸡攻毒后,从4周起开始检出病毒血症,然后比例逐渐增加,在第8周时所有9只鸡全部检出病毒血症。含母源抗体组鸡攻毒后,12只中只有4只鸡检出病毒血症,最早也在7周后才被检出,而且病毒血症都是一过性的,最多持续4周,而其他8只鸡在连续观察的14周内始终未检出病毒血症。由以上实验结果足以得出以下结论:该疫苗能使全部产蛋祖代鸡产生较高水平的特异性抗体,并且能通过卵黄抗体为雏鸡提供母源抗体保护,可以抵抗B亚群禽白血病病毒的早期感染,可以有效控制B亚群禽白血病的发展,在核心种鸡群中应用后可加快B亚群禽白血病的净化的进程。
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