弱毒突变体对烟草脉带花叶病毒的交叉保护作用

【摘要】：交叉保护是指一种病毒侵染植株后可阻止相同病毒的不同株系或亲缘关系较近的另一种病毒侵染该植株的现象。交叉保护对病毒病的防治效果非常明显，已成功地用来防治番茄花叶病、柑橘衰退病、番木瓜环斑病、黄瓜花叶病和西葫芦黄色花叶病等多种病毒病。但交叉保护作为一种常规防治方法仍存在一定缺陷：弱毒株系有突变为强毒株系的风险，弱毒株系可能与其它病毒有协生作用从而造成严重的损失，弱毒株系有可能传播到非靶标寄主上造成危害。针对以上问题，本实验对烟草脉带花叶病毒（Tobaccovein banding mosaic virus, TVBMV）辅助成分-蛋白酶（Helper component-proteinase,HC-Pro）中调控致病力、协生和蚜虫传毒的氨基酸进行突变，获得多位点突变、与PVX无协生作用、不能蚜传的弱毒突变体。本文主要结果如下： 1．构建了分别含有两个、三个或四个氨基酸突变的弱毒突变体共10个，病毒致病力进一步下降，浓度降低。TVBMV HC-Pro中的NRT突变为ART（B）、FRNK突变为FINK（C）、CDN突变为CKN（D）、IQN突变为DEN（E），可显著降低TVBMV的致病力和植株体内的浓度，同时使其丧失与PVX的协生能力。而HC-Pro中RITC突变为EITC（A），TVBMV不能经由蚜虫传播。本论文利用定点突变技术，将上述突变引入携带gfp的TVBMV侵染性克隆pCamTVBMV，获得四个双位点突变体BC、BD、CE、DE，四个三位点突变体ACE、ADE、BCE、BDE，两个四位点突变体ABCE、ABDE。 利用农杆菌浸润法接种本氏烟（Nicotiana benthamiana），5-7天后野生型TVBMV产生脉明症状，新生叶片畸形，紫外灯下可见强烈的绿色荧光，后期顶部叶片严重畸形，植株不再生长。而多位点突变体接种的本氏烟上未出现明显症状，荧光强度明显降低或观察不到。ELISA检测结果显示，突变体在植株中积累量很低，远低于野生型。RT-PCR检测证明在接种的本氏烟系统叶片中可以检测到病毒RNA。多位点突变体可系统侵染普通烟，但不产生明显症状。 2．弱毒突变体与PVX（Potato virus X，PVX）无协生作用。将携带TVBMV弱毒突变体与野生型PVX的农杆菌GV3101培养液等体积混合后，共浸润本氏烟和普通烟。野生型TVBMV和PVX复合侵染本氏烟，引起本氏烟的系统坏死，而TVBMV多位点突变体与PVX共浸润本氏烟只是产生花叶症状，与单独注射PVX的本氏烟症状相近。ELISA检测进一步证实，多位点突变体与PVX共浸润本氏烟后，PVX CP积累量与单独接种野生型PVX相近，显著低于野生型TVBMV和PVX的植株中PVX的积累量。接种普通烟上的结果与本氏烟一致。这些结果表明，获得的十个弱毒突变体丧失与PVX协生的能力。 3.部分TVBMV弱毒突变体丧失蚜传能力。将携带弱毒突变体ACE、ADE、ABCE和ABDE及野生型TVBMV的农杆菌浸润本氏烟，20天后，将无毒蚜虫饥饿处理2h，饲毒5min后转移到将健康的本氏烟上，12h后喷药将蚜虫杀死。蚜传后6天，取食野生型TVBMV的蚜虫接种的本氏烟无系统症状，但紫外光下可在顶部叶片局部观察到绿色荧光；蚜传后8天，取食野生型TVBMV的蚜虫接种的本氏烟顶部叶片出现明脉现象，紫外灯下可见叶脉布满绿色荧光。取食弱毒突变体ACE、ADE、ABCE和ABDE的蚜虫接种的本氏烟8天后无任何症状，在紫外光下观察不到绿色荧光，RT-PCR也检测不到病毒。这表明弱毒突变体ACE、ADE、ABCE和ABDE丧失了蚜传能力。 4.多位点突变体对野生型TVBMV有良好的保护效果。接种本氏烟后间隔11天、7天和3天接种强毒，攻毒后第5天、10天和15天，在自然光下观察本氏烟上的症状，在紫外灯下观察绿色荧光强度和面积，并进行ELISA检测，结果表明，保护接种的本氏烟症状减轻，荧光强度减弱，病毒积累量降低，在保护期为7天时，突变体对TVBMV都有一定的保护效果，但保护期为11天时保护效果更好。在这些突变体中单位点突变体B、E和双位点突变体BC交叉保护效果更好。