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《山东农业大学》 2014年
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B亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备

辛敬凯  
【摘要】:禽白血病是危害我国养禽业的一大病毒性肿瘤病,由于其亚型较多,分布广泛,且垂直传播,因而,对此病的防制和净化有一定难度。在我国的地方品系鸡群中,禽白血病感染呈现较为严重的状态。相关研究学者在过去一段时期内对禽白血病研究偏向于致病性较强的J亚群病毒,而忽略了经典的A/B亚群病毒,这间接的造成了本已存在于我国地方品系鸡群中A/B亚群禽白血病病毒的泛滥。净化地方品系鸡群中A/B亚群禽白血病病毒,成为了当务之急,研制针对性的单克隆抗体,建立标准化检测试剂盒,实现对疾病快速而准确地监控,是需首要完成的任务。 本实验旨在制备针对B亚群禽白血病病毒的单克隆抗体。首先,利用IDEXX公司的AB亚群禽白血病病毒抗体检测试剂盒对山东某地方寿光鸡场鸡群进行检测,结果显示抗体阳性率达70.37%(95/135)。剖检病鸡,观察脏器病理变化,无菌采取表面有肉眼看见肿瘤结节的肝脏、脾脏等脏器,制备组织切片进行观察。将病料冻存于超低温冰箱,作为提取病毒和前病毒DNA的病料。 利用病鸡脾脏提取病毒液,并接种于DF-1细胞扩增病毒。用p27抗原检测试剂盒检测细胞上清,确定病毒存在,并命名为ALV-B-SG12,于超低温冰箱冻存病毒液。采用宝生物公司DNAiso Reagent基因组DNA提取试剂处理病料,进行前病毒DNA的提取,以获取目的基因。区分禽白血病病毒不同亚群的主要依据为gp85囊膜蛋白,不同亚群gp85基因序列的差异性决定了病毒囊膜蛋白的抗原特异性。针对ALV-B的gp85基因设计引物,进行扩增、回收和测序。结果显示1038bp测准。与国内外报道的12株ALV-A同源率在85%左右,与6株ALV-B的同源率达90%以上,其中与RAV-2、WB11080、RSV-SCHMIDT-RUPPIN_B以及JS-B1203四株的同源性高达96%以上。 将回收产物连接入pET32a载体,转化进BL21大肠杆菌原核表达菌株,进行目的蛋白的表达。优化表达条件,从IPTG浓度、温度和时间三个方面进行试验,对每次试验进行SDS-PAGE检测。最终确定最适诱导表达条件为:IPTG浓度0.1mmol/L、温度30℃、诱导时间8h。超声裂解菌液,过Ni柱纯化后,进行SDS-PAGE检测,在53kDa处有明显条带。用TGE透析液进行纯化蛋白的复性,最终生产出可以作为特异性免疫原的活性蛋白。 在获得纯化蛋白后,首先建立间接ELISA检测方法,通过一系列对比试验确定最佳反应条件为抗原包被浓度3μg/ml、血清稀释度为1:1000、二抗的稀释比例为1:2000。于1、15、30d免疫若干BALB/c小鼠,免疫量50μg纯化蛋白每只每次,尾静脉采集血液,分离血清,用建立好的方法进行检测,显示效价均高达1:26~29。取三免后加强免一次的小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞按3~5:1进行细胞融合,前后共进行八次细胞融合工作,最终通过间接ELISA方法检测出阳性孔。对阳性孔进行扩增和冻存,并取部分阳性孔细胞利用有限稀释法进行亚克隆,筛选出单克隆的阳性细胞株。利用单克隆抗体进行IFA检测,以及抗体分泌稳定性试验,可得所制备的单抗对B亚群禽白血病病毒具有较高特异性且分泌稳定。
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