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《山东农业大学》 2016年
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苹果HMGR基因家族启动子的克隆及功能分析

吕东梅  
【摘要】:萜类化合物不仅对植物的生长发育具有重要作用,同时也具有重要的商业价值。近年来,萜类代谢工程已成为研究热点。了解萜类合成途径的代谢调控对于利用代谢工程及基因工程等获得有用的萜类化合物具有重要意义。HMGR是萜类合成中的甲羟戊酸代谢途径的第一个限速酶,它催化HMG-CoA形成MVA,是细胞质萜类代谢中的重要调控位点。植物中的HMGR常以小基因家族的方式存在。它在植物的生长发育中起重要作用,同时对植物适应各种生理和环境因子起作用。本研究首先鉴定了苹果HMGR基因家族的MdHMGR1、MdHMGR2及MdHMGR3三个基因的组织表达模式及诱导表达模式。然后克隆并获得了苹果HMGR基因家族的启动子序列,并通过HMGR启动子驱动的GUS基因在转基因拟南芥中的时空表达模式及诱导表达模式确定苹果HMGR基因表达的组织特异性及诱导因素。进一步通过缺失分析鉴定HMGR启动子不同区域的功能。本实验通过研究苹果HMGR启动子的结构和功能,以在转录水平了解苹果HMGR基因的分子调控机制,进一步为苹果MVA代谢途径的调控提供理论基础。主要结果如下:(1)苹果HMGR基因家族的MdHMGR1、MdHMGR2及MdHMGR3三个基因虽然在苹果嫩叶、老叶、茎、根及果实中均有表达,但表达模式有很大不同。MdHMGR1基因在根及果实中表达量最高,并且在不同组织中的表达水平差距不大。MdHMGR2基因的表达水平在根中最高,其次为果实、茎、嫩叶、老叶,表达水平在老叶中最低,其表达具有组织特异性。MdHMGR3基因在果实及根中表达量最高,并且在不同组织中的表达水平差距不大。(2)苹果HMGR基因家族的MdHMGR1、MdHMGR2及MdHMGR3三个基因在ABA、ETH、GA、IAA、MeJA及SA处理下的诱导表达模式也有很大不同。在处理2h或4h时,MdHMGR1基因在这些激素的诱导处理下表达虽有所提高,但不显著。MdHMGR2基因在这些激素的诱导处理下表达均有所提高,其中MdHMGR2基因在ETH、IAA、MeJA及SA处理4h下均有显著提高,而MdHMGR2基因在ABA及GA处理4h时表达水平虽有所升高,但不显著。在处理2h或4h时,MdHMGR3基因在这些激素除了ABA之外的诱导处理下表达虽有所提高,但不显著。(3)将从NCBI上获得的苹果HMGR2mRNA序列(GenBank:EF580921.1)与苹果基因组数据库中的序列MDC015298.78(http://www.rosaceae.org/)进行比对,获得hmgr2基因编码序列上游2000bp序列,根据该序列设计引物phmgr2f和phmgr2r,从青香蕉苹果基因组dna中扩增得到包含启动子在内的1509bp序列。(4)根据苹果hmgr2mrna序列(genbank:ef580921.1)设计特异性引物hmgr2gsp和hmgr2ngsp,并进行5′smart-racepcr扩增,将第二轮pcr产物与pmd-18t载体连接并转化大肠杆菌,利用pcr鉴定阳性转化子并挑选15个阳性克隆进行摇菌并测序。结果表明,mdhmgr2基因的转录起始位点位于起始密码子上游156bp处的a碱基。(5)通过plantcare及place数据库对mdhmgr2启动子序列进行预测分析,结果在-35至-29处有一个tata-box,其序列为tataaaa,这与tata-box通常位于转录起始位点上游32±7碱基的规律一致,表明其为典型的启动子。同时发现mdhmgr2启动子还含有许多响应激素的顺式作用元件及与组织特异性表达有关的元件。(6)获得mdhmgr2启动子全长及其5′-缺失序列片段,共6个,与植物表达载体pbi121-gus进行重组,替代其上的camv35s启动子,获得一系列重组表达载体,分别命名为mdhmgr2p-d1、mdhmgr2p-d2、mdhmgr2p-d3、mdhmgr2p-d4、mdhmgr2p-d5及mdhmgr2p-d6。将该系列载体进行酶切鉴定及测序鉴定,发现构建成功。将构建好的启动子系列载体转化gv3101,并用花序浸染法转化拟南芥,并将获得的t3代转基因拟南芥纯化株系用于下一步的研究。(7)通过gus组织化学染色法研究mdhmgr2全长启动子在转基因拟南芥中的表达模式。结果发现,在含有mdhmgr2p-d1片段的转基因拟南芥中,gus在幼苗期3d、5d、10d及15d的根、下胚轴及子叶中均有表达,且表达量较高。而在30d的转基因拟南芥中,gus只在根及刚长出的幼叶中有少量表达。在50d的转基因拟南芥中,在完全伸展开的成熟叶片中无gus表达,而在刚长出的幼叶中有少量表达。在花发育时期,gus在花药及柱头中表达量较高。而在花瓣、雌蕊、果荚及种子中均不表达。进一步观察发现,gus在花药中的花粉粒及花药壁中均有表达。(8)在含有mdhmgr2p-d2片段的转基因拟南芥中,gus表达模式与在含有mdhmgr2p-d1片段的转基因拟南芥中的表达模式相似,只是在表达量上有所降低。在含有mdhmgr2p-d3片段的转基因拟南芥中,gus在幼苗期3d、5d、10d及15d的根尖及子叶中均有表达,且表达量较低,而在下胚轴中不表达。而在30d的拟南芥苗中只在刚长出的幼叶中有少量表达。在50d的转基因拟南芥中,在完全伸展开的成熟叶片中无gus表达,而在刚长出的幼叶中有少量表达。在花发育时期,gus活性只在花药及柱头中有表达。而在花瓣、雌蕊、果荚及种子中均不表达。进一步观察发现,GUS在花药中的花粉粒及花药壁中均有表达。对含有MdHMGR2P-D1、MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的拟南芥10d幼苗中的GUS酶活进行荧光定量分析,结果发现GUS表达活性在含有MdHMGR2P-D1的拟南芥植株中最高。而在含有MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的拟南芥植株中GUS表达活性分别只达到了含有MdHMGR2P-D1拟南芥植株的GUS活性的67%和21%。结果表明,MdHMGR2启动子片段-1050至-827的缺失导致了GUS活性的大幅下降。在含有MdHMGR2P-D4、MdHMGR2P-D5及MdHMGR2P-D6的转基因拟南芥植株中,GUS活性在任何组织及任意时期中均未检测到。以上结果表明,MdHMGR2启动子-1050至-827区域对于该启动子维持高水平的活性具有重要作用。(9)通过GUS组织化学染色法发现,在含有MdHMGR2P-D1的转基因拟南芥植株中GUS活性也受ETH、IAA、MeJA及SA诱导表达。含有MdHMGR2P-D4、MdHMGR2P-D5及MdHMGR2P-D6的转基因拟南芥植株在这些激素处理下仍然检测不到GUS表达。通过GUS酶活荧光定量分析发现,在ETH处理下,在含有MdHMGR2P-D1转基因拟南芥中,GUS活性升高。而在含有MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的拟南芥植株中,GUS活性未受诱导。在含有MdHMGR2P-D1、MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的转基因拟南芥中,GUS活性表达水平均受IAA、MeJA及SA诱导。通过EMSA分析发现,有特异性的蛋白质与MdHMGR2启动子-1050至-1005区域的ERE元件结合。结果表明,MdHMGR2启动子-1050至-1005区域对于该启动子应答乙烯具有重要作用。(10)扩增得到了一个与MdHMGR3基因同源性高达97.04%的Md HMGR3-like基因。表达模式分析发现,Md HMGR3-like基因在根中表达水平远高于其它组织并且受ETH、MeJA及SA显著诱导。进一步扩增得到了MdHMGR3及MdHMGR3-like启动子,二者序列比对发现,其同源性为49.21%。将MdHMGR3及MdHMGR3-like启动子分别转入拟南芥中,结果显示,MdHMGR3启动子驱动GUS基因在拟南芥中以高水平呈组成型表达,而MdHMGR3-like启动子驱动GUS基因在拟南芥中表现为根组织特异性表达。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q943.2

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