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《山东农业大学》 2017年
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中间偃麦草天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1的功能分析

田秋菊  
【摘要】:小麦是我国种植最广泛的农作物之一,全球大约1/3的人口以小麦为主食。但是,小麦白粉病和赤霉病一直是影响小麦高产、稳产的重要限制因素。因此,挖掘新的抗病基因,培育出含有多个抗病基因聚合的抗病小麦品种是目前亟待解决的问题。在前期研究中,从小偃麦异附加系SN6306(高感白粉的小麦品种烟农15与中间偃麦草杂交后代)中克隆到了一个与白粉病抗性相关的天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1。本研究以天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1为研究对象,对TiAP1基因的功能及作用机制进行分析,主要结果如下:(1)TiAP1蛋白的生物信息学分析目的蛋白为天冬氨酸蛋白酶,通过对跨膜螺旋进行预测,发现目的蛋白没有跨膜结构,因此不是跨膜蛋白。同时对蛋白的许多物理化学特性进行了分析,目的蛋白含有506个氨基酸,等电点为5.6,含有信号肽,信号肽的切割位点位于第16和17个氨基酸之间。除此之外还对蛋白的二级结构和三级结构进行了预测,该蛋白的二级结构中延伸链和无规则卷曲所占的比例较高,三级结构构建的模型比较稳定。(2)原核表达系统进行蛋白质的功能分析利用本实验室现有的pET-28a载体与密码子优化后的目的序列构建原核表达载体pET-AP,重组质粒转入BL21中,加入IPTG诱导大肠杆菌表达,37℃诱导过夜,利用SDS-PAGE电泳,在45KD附近出现了目的条带。利用Western blot对目的蛋白进行检测,证明诱导表达成功。利用亲和层析,在将目的蛋白分离纯化出来的过程中,发现目的蛋白表达是以包涵体的形式。将目的蛋白纯化复性后进行白粉病菌孢子和赤霉病菌孢子的萌发试验,结果发现目的蛋白会抑制白粉病菌和赤霉病菌的孢子的萌发,(3)TiAP1蛋白作用机制分析通过分生孢子萌发实验,发现TiAP1蛋白可以影响白粉病菌和禾谷镰刀菌分生孢子的萌发。为了进一步确定目的蛋白的作用机制,将禾谷镰刀菌的菌丝和分生孢子分别放入蛋白储存液、低浓度(0.146mg/ml)蛋白、高浓度(0.291mg/ml)蛋白溶液中孵育,孵育结束后,加入荧光染料SYTOX Green,观察。结果发现在蛋白储存液中孵育之后的菌丝和分生孢子加入荧光染料之后也没有荧光产生;经过低浓度蛋白溶液孵育后的菌丝和孢子,在显微镜下菌丝和分生孢子带有微弱的荧光;高浓度的蛋白溶液中荧光增强。以上结果说明TiAP1蛋白可以增加细胞膜的通透性。(4)转基因小麦对白粉病菌的抗性鉴定本实验室前期研究中得到了转基因BobWhite小麦,进行小麦白粉病菌E09的苗期抗病性鉴定,发现转基因小麦植株叶片上的孢子数明显少于对照。说明TiAP1基因可能会延缓白粉病的侵染速度。此外,为了进一步探究TiAP1基因可能参与的抗白粉病的途径,通过白粉病菌诱导,转基因小麦中茉莉酸甲酯的标记基因OPDA、PR10、COL1标记基因跟0h和对照相比,表达量明显上调,其中PR10的表达量上调最多,是0h的20倍左右。这些结果表明TiAP1基因可能参与了茉莉酸激素调节途径。(5)转基因拟南芥对Pst DC3000响应将之前构建好的拟南芥表达载体pRI-AP1,基因转入拟南芥中后,经过筛选,得到转基因拟南芥。随后,将Pst DC3000菌喷洒野生型拟南芥,收集处理3d后的叶片进行苯胺蓝、台盼蓝、DAB染色,用以检测叶片中胼胝质的积累、活性氧的测定以及会死细胞的含量,结果表明转基因拟南芥中胼胝质、坏死细胞、活性氧积累的要比野生型多。这些结果表明TiAP1基因可以增强拟南芥对Pst DC3000的抗性。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S435.121.4

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