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《山东农业大学》 2017年
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烟草脉带花叶病毒和马铃薯X病毒的协生作用及二者侵染本氏烟的转录组学分析

王红艳  
【摘要】:马铃薯Y病毒属成员与马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)在生产中常常复合侵染植株产生协生作用,引起更为严重的症状。烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV)是马铃薯Y病毒属的一个确定种,能够自然侵染烟草、马铃薯、番茄等茄科作物,在生产中的危害逐年加重。随着高通量测序技术的应用,利用转录组测序技术对植物转录本分析的研究逐渐成为热点,但是应用于研究病毒协生作用的分子机制方面的报道还很少。本研究以实验室自主构建的携带GFP的TVBMV侵染性克隆、将HC-Pro的CDN基序中D198突变为K并将中间区域的IGN突变为DEN而失去协生能力的弱毒突变体以及PVX侵染性克隆为基础,研究TVBMV与PVX的协生作用,并利用RNA-Seq技术研究TVBMV野生型及弱毒突变体分别与PVX复合侵染本氏烟过程中差异表达的寄主基因,研究马铃薯Y病毒属病毒与PVX协生作用影响的寄主代谢通路;利用小RNA测序技术鉴定侵染芝麻的病毒种类,克隆获得1个TVBMV芝麻分离物的全基因组序列并分析了其分子变异情况。具体结果如下:从病害症状、病毒含量等方面研究了TVBMV与PVX的协生。本氏烟接种PVX后第10天,系统叶片表现花叶症状;TVBMV与PVX共同接种本氏烟,在系统叶片引起花叶及卷曲症状,导致植株生长迟缓;弱毒突变体与PVX共同接种本氏烟,仅在植株上部叶片引起轻微的花叶症状。TVBMV与PVX共同接种后第14天,本氏烟植株出现矮化和坏死,弱毒突变体与PVX复合侵染仅引起与PVX相同的花叶症状。共同接种本氏烟后第20天,TVBMV与PVX协生加重了病害症状、显著抑制烟草植株的生长,并造成了植株顶部叶片的坏死,而无协生作用的弱毒突变体与PVX复合侵染仅造成了与PVX单独侵染相似的花叶症状。ELISA检测结果表明,TVBMV与PVX复合侵染在接种后第6天TVBMV病毒积累量开始明显升高,并且与单独接种TVBMV的本氏烟中病毒积累量相当;弱毒突变体与PVX复合侵染后TVBMV病毒积累量远低于野生型TVBMV与PVX复合侵染的本氏烟,且病毒积累量一直维持在较低水平。利用RNA-Seq技术研究了TVBMV野生型及弱毒突变体分别与PVX复合侵染过程中本氏烟的转录组变化情况。病毒在接种后第2天大量复制,接种后第2天的接种叶片及第10天的系统叶片中均含有大量的病毒RNA,clean reads能比到本氏烟参考基因组上的较少。GO富集分析显示,TVBMV与PVX的复合侵染导致大量寄主基因发生异常表达,干扰了寄主的正常代谢,影响了寄主蛋白和酶代谢相关基因、DNA复制相关基因、光合作用相关基因等,使寄主产生一系列的细胞组分、生物过程、分子功能的改变。与弱毒突变体与PVX的侵染相比,侵染前期TVBMV与PVX协生影响DNA复制通路17个基因上调表达,系统侵染后造成与细胞壁合成相关的33个基因和与光合作用相关的蛋白复合体及外周天线61个基因的下调表达以及RNA沉默途径DCL2和RDR1基因的上调表达。KEGG分析表明,与弱毒突变体与PVX的侵染相比,TVBMV与PVX协生,诱导核糖体合成相关基因的表达以帮助病毒蛋白合成;之后通过抑制光合作用相关代谢通路,抑制细胞壁合成相关酶的代谢通路,调节激素介导的信号转导通路,引起植株的花叶和坏死。同时,植物的SA信号途径受到诱导,产生大量PR蛋白以防御病毒的侵染。将从济南章丘芝麻田中采集的表现黄绿花叶、细叶及皱缩的芝麻病株叶片进行小RNA测序,检测到西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus,BCMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)等三种马铃薯Y病毒属病毒,其中TVBMV能够自然侵染芝麻系首次报道,也是TVBMV能够侵染除茄科以外作物的首次报道。进一步RT-PCR及血清学检测证实了小RNA的测序结果。利用步移扩增和5'RACE方法获得了TVBMV-Zhangqiu分离物的全基因组序列,其全基因组序列为9596个核苷酸。TVBMV-Zhangqiu分离物与山东沂源的YY分离物(JN630472)的核苷酸及氨基酸一致率最高,分别为97.89%和99.06%;系统进化分析表明,TVBMV-Zhangqiu分离物聚类到来源于中国大陆的MC组;重组分析表明TVBMV-Zhangqiu分离物是SDYS1与YN分离物的潜在重组体,属于MC组的组内重组,其基因组的主要亲本是SDYS1,8642nt-9533 nt来源于YN;TVBMV-Zhangqiu与TVBMV-HN39接种芝麻的症状存在差异,Zhangqiu分离物接种后仅表现轻花叶症状,HN39分离物接种后的芝麻植株花叶明显且生长迟缓、植株矮化。
【关键词】:烟草脉带花叶病毒 马铃薯X病毒 弱毒突变体 协生作用 致病力 马铃薯Y病毒属 转录组
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S432.41
【目录】:
  • 符号说明6-11
  • 中文摘要11-13
  • ABSTRACT13-16
  • 1 前言16-29
  • 1.1 烟草脉带花叶病毒16-19
  • 1.1.1 发生与危害16-17
  • 1.1.2 全基因组序列与结构17-18
  • 1.1.3 蛋白序列及功能的研究18-19
  • 1.2 马铃薯X病毒19-21
  • 1.3 病毒的相互作用21-24
  • 1.3.1 协生作用21-24
  • 1.3.2 拮抗作用24
  • 1.4 二代测序在植物病毒研究中的应用24-27
  • 1.4.1 二代测序技术研究病毒与寄主植物的互作25
  • 1.4.2 二代测序技术鉴定植物病毒25-27
  • 1.5 芝麻病毒病27
  • 1.6 本研究的目的意义27-29
  • 2 材料与方法29-53
  • 2.1 材料29-30
  • 2.1.1 样品及毒原29
  • 2.1.2 供试植物29
  • 2.1.3 菌株29
  • 2.1.4 血清29
  • 2.1.5 生化试剂、试剂盒与酶29-30
  • 2.1.6 寡聚核苷酸引物30
  • 2.1.7 主要实验仪器30
  • 2.2 方法30-53
  • 2.2.1 侵染性克隆的接种30-33
  • 2.2.2 间接ELISA法检测病毒积累量33-35
  • 2.2.3 RT-PCR检测病毒35-36
  • 2.2.4 本氏烟的转录组数据分析36-43
  • 2.2.5 芝麻病叶的小RNA测序43-44
  • 2.2.6 验证小RNA测序结果44-48
  • 2.2.7 TVBMV芝麻分离物全基因组序列测定48-51
  • 2.2.8 TVBMV芝麻分离物全基因组序列分析51-53
  • 3 结果与分析53-98
  • 3.1 TVBMV与PVX的协生53-59
  • 3.1.1 TVBMV野生型及弱毒突变体T-HCM与PVX侵染本氏烟的症状53-57
  • 3.1.2 检测TVBMV野生型及弱毒突变体与PVX侵染本氏烟病毒的积累量57-59
  • 3.2 TVBMV野生型及弱毒突变体与PVX复合侵染的转录组学分析59-88
  • 3.2.1 RNA样品的提取及质量检测59
  • 3.2.2 测序数据的初步分析59-61
  • 3.2.3 基因表达水平分析61-62
  • 3.2.4 基因差异表达分析62-67
  • 3.2.5 差异基因的GO富集分析67-73
  • 3.2.6 差异基因的KEGG富集分析73-75
  • 3.2.7 荧光定量RT-PCR验证RNA-seq数据的准确性75
  • 3.2.8 荧光定量PCR验证关键通路基因75-78
  • 3.2.9 协生引起的病害症状的相关因子78-88
  • 3.3 感病芝麻样品的小RNA测序及分析88-91
  • 3.3.1 感病芝麻样品的田间症状88-89
  • 3.3.2 RNA样品的提取及质量检测89
  • 3.3.3 序列处理89-90
  • 3.3.4 小RNA测序结果90
  • 3.3.5 RT-PCR检测芝麻样品中的TVBMV90-91
  • 3.3.6 序列测定及分析91
  • 3.3.7 Western blotting检测芝麻样品TVBMV蛋白表达水平91
  • 3.4 TVBMV芝麻分离物全基因组测序及分析91-98
  • 3.4.1 RT-PCR结果91-92
  • 3.4.2 序列测定92
  • 3.4.3 基因组结构92-93
  • 3.4.4 核苷酸和氨基酸一致率93-94
  • 3.4.5 系统进化关系94
  • 3.4.6 重组分析94-95
  • 3.4.7 生物学性状95-96
  • 3.4.8 全基因组序列96-98
  • 4 讨论98-102
  • 4.1 病毒的协生作用98-99
  • 4.2 病毒复合侵染本氏烟引起的转录组变化99-100
  • 4.3 协生作用与单独侵染本氏烟的转录组数据比较100-102
  • 5 结论102-103
  • 参考文献103-115
  • 致谢115-116
  • 攻读学位期间发表论文情况116

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>于晓庆 >王红艳
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