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《山东农业大学》 2017年
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鸭甲肝病毒3'非编码区功能及干扰素信号通路研究

张瑞华  
【摘要】:鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)引起的鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是危害养鸭业最为严重的传染病之一,主要病发于1~3周龄的雏鸭,可引起90%以上的死亡率,而35日龄以上的鸭感染DHAV后仅见一过性的精神沉郁。另外,临床感染DHAVs的病、死雏鸭尽管日龄不同,但同一脏器中病毒含量类似,这提示我们DHAV可以逃逸雏鸭尚未发育完善的免疫系统而增殖、致病。DHAV作为小RNA病毒科禽肝病毒属的唯一成员,包括三个基因型,分别对应于三个血清型DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。目前对该病毒的研究已经从基因检测、克隆测序、进化树分析等过渡到了对其基因组功能和病毒与宿主之间相互作用的研究。小RNA病毒3’UTR中存在的茎环结构、Poly(A)尾等二级结构可以通过与病毒其他部位、病毒蛋白或宿主细胞的蛋白相互作用来实现对病毒复制和翻译的调控,并以此影响病毒的感染力,目前尽管已对多种小RNA病毒3’UTR的结构与功能进行了研究,其调控病毒复制和翻译的分子机制也得到了部分阐明,但关于DHAV 3’UTR结构与功能的研究在国际上仍属于空白区。基于此,本课题以本实验室前期制备的DHAV-1(LY0802株)和DHAV-3(SD1201株)DNA-Launched(DHAV-1L,DHAV-3L)传染性克隆为基础,研究了DHAV-1和DHAV-3 3’UTRs对病毒感染力的影响。另外本研究结合DHAV感染DEF后的RNA-seq分析,对DHAV感染的干扰素信号通路进行了研究,尝试从机体免疫、病毒与机体相互作用的层面入手,通过机体免疫功能的变化来解释鸭病毒性肝炎的致病机理。(1)DHAV 3’UTR对病毒感染力的研究本研究从NCBI收录的DHAV毒株中随机选取5株DHAV-1、2株DHAV-2和5株DHAV-3分别进行Megalian分析,发现相同基因型的DHAV 3’UTR具有相对保守的序列,而不同基因型DHAV的3’UTR序列中存在有共有基序α和β。使用RNAfold在线软件预测LY0802和SD1101 3’UTR的二级结构,除了poly(A)外,发现LY0802的3’UTR存在7个茎环结构,SD1101的3’UTR存在3个茎环结构,而保守序列α位于1L-C和3L-B茎环区,β位于1L-FG和3L-C茎环区。据此,本研究根据RNAfold预测结果构建了一系列的DHAV-1和DHAV-3 3’UTR缺失株。首先通过透射电镜验证了DNA-Launched的病毒装载有效性并发现DHAV-1 3’UTR全部缺失毒可以感染DEF并对宿主细胞造成轻微病变,这初步说明3’UTR对DHAV-1在细胞上的增殖是非必需的。接着本研究通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和酶联免疫吸附试验从基因和蛋白水平上对DHAV 3’UTR突变病毒在细胞中的增殖进行了进一步鉴定,结果证实了DHAV 3’UTR对病毒的增殖有很大影响但并不是必需的。为了鉴定DHAV 3’UTR的关键结构域,本研究通过分子病毒转染和感染两种模式,鉴定出了DHAV-1 3’UTR的关键结构域C和G、DHAV-3 3’UTR的关键结构域C,另外,结合DHAV感染DEF后的RNA-seq分析,1Δ1-314和1Δ1-339引起的宿主表达差异基因分别为415个(上调178,下调237)和4033个(上调1755,下调2278),我们证实虽然Poly(A)尾对DHAV-1病毒的复制不是必需的,但它的确可以影响DHAV的感染力。(2)DHAV感染DEF后的转录组测序分析DHAV-1L感染DEF细胞后对宿主细胞的m RNA做转录组学分析,发现差异表达基因5828个,其中上调基因为2025个,下调基因为3803个。所有差异基因被归类注释为67条GO term,涉及生物学过程(biological processes,BP)、细胞组分(cellular components,CC)及分子功能(molecular functions,MF)三大类。根据KEGG注释结果,差异表达基因富集在35条信号通路,其中信号转导通路最为富集,其次为内分泌系统通路和免疫系统通路。在与先天免疫相关的Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、RIG-I受体信号通路(RIG-I-like receptor signaling pathway)和NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)三大模式识别受体信号通路中,DHAV感染组宿主的IκB、IL-6和IL-8在这三个通路中都有显著上调,另外在Toll样受体信号通路中,P13K、TRAF3和TBK1有显著下调,在RIG-I受体信号通路中,基因TRAF3、TBK1和MEKK1有显著下调,在NOD样受体信号通路中,Erbin有显著下调。IκB显著上调可以抑制NF-κB的解离入核,TRAF3和TBK1的显著下调抑制了IKKε/TBK1的活性从而阻止IRF3/7的转录活性。这两条通路共同抑制IFN-β的表达。据此我们推测DHAV-1L感染DEF后宿主干扰素基因或未得转录。(3)DHAV-1感染DEF后的干扰素信号通路研究本研究用等量DHAV-1L感染DEF后,分别于4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h收集感染DHAV的DEF上清和细胞,对细胞总RNA进行干扰素β基因检测,结果发现DHAV-1L在DEF中的复制没有引起宿主细胞干扰素β基因的转录。然后又以聚肌胞转染感染DHAV-1的DEF细胞作为阳性对照,用酶联免疫法检测DEF细胞上清中干扰素蛋白的分泌,并用荧光定量PCR检测干扰素诱导基因PKR、OAS和Mx的基因转录,结果发现DHAV的感染可以抑制宿主细胞内ds RNA对IFN-β的诱导作用且不同毒力的DHAV对IFN-β的抑制能力也不同,另外DHAV的感染还可以抑制ISGs的转录。
【关键词】:1型鸭甲肝病毒 3型鸭甲肝病毒 3’UTR 电镜 转录组 增殖 干扰素
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 符号说明6-10
  • 摘要10-13
  • abstract13-16
  • 1 前言16-39
  • 1.1 小RNA病毒 3’非编码区介绍16-25
  • 1.1.1 小RNA病毒 3’非编码区的重要结构及功能16-19
  • 1.1.2 小RNA病毒 3’UTR发挥功能的重要分子机制19-21
  • 1.1.3 鸭甲肝病毒研究进展21-25
  • 1.2 禽类干扰素刺激基因概论25-33
  • 1.2.1 干扰素分类25-27
  • 1.2.2 干扰素介导的信号转导27-32
  • 1.2.3 鸭干扰素信号通路研究的必要性32-33
  • 1.3 转录组研究技术概述33-38
  • 1.3.1 RNA-Seq测序技术的基本原理34
  • 1.3.2 RNA-Seq测序技术流程34-37
  • 1.3.3 RNA-Seq测序技术的应用37-38
  • 1.4 本研究的目的与意义38-39
  • 2 材料与方法39-60
  • 2.1 材料39-40
  • 2.1.1 毒(菌)株39
  • 2.1.2 实验动物和细胞株39
  • 2.1.3 主要仪器39
  • 2.1.4 主要试剂39-40
  • 2.2 方法40-60
  • 2.2.1 鸭甲肝病毒 3’UTR的序列分析40-48
  • 2.2.2 DHAV DNA-Launched分子缺失株的初步鉴定48-51
  • 2.2.3 DHAV分子毒与各缺失株的荧光定量检测51-53
  • 2.2.4 DHAV分子毒与缺失株的酶联免疫吸附试验53-54
  • 2.2.5 DHAV分子毒与缺失株的毒力鉴定54
  • 2.2.6 DHAV-1L及 3’UTR缺失株的转录组试验设计54-57
  • 2.2.7 DHAV感染宿主细胞的干扰素信号通路初探57-59
  • 2.2.8 DHAV-1L感染DEF后的ISGs检测59-60
  • 3 结果60-92
  • 3.1 DHAV DNA-Launched 3’UTR缺失株的序列分析60-63
  • 3.2 DHAV DNA-launched 3’UTR缺失株的构建63-67
  • 3.2.1 目的片段的扩增63-66
  • 3.2.2 DHAV DNA-Launched缺失毒株双酶切鉴定图66-67
  • 3.3 DHAV分子毒与缺失毒的初步鉴定67-71
  • 3.3.1 DHAV分子毒的电镜鉴定67-68
  • 3.3.2 DHAV分子病毒转染BHK-21 后的间接免疫荧光试验68-70
  • 3.3.3 DHAV分子病毒感染DEF后的间接免疫荧光试验70-71
  • 3.4 DHAV分子毒的mRNA水平检测71-75
  • 3.4.1 DHAV分子毒株转染BHK-21 后实时荧光定量检测71-73
  • 3.4.2 DHAV分子毒株感染DEF后的实时荧光定量检测73-75
  • 3.5 DHAV分子毒的蛋白水平检测75-76
  • 3.6 DHAV分子病毒的毒力鉴定76-79
  • 3.6.1 DHAV分子病毒的细胞半数感染量(TCID50)测定76-77
  • 3.6.2 DHAV分子病毒感染的动物试验77-79
  • 3.7 DHAV-1 感染DEF后的转录组测序结果评估79-85
  • 3.7.1 总RNA样品质量检测79
  • 3.7.2 转录本拼接结果统计79-80
  • 3.7.3 Unigene表达差异分析80
  • 3.7.4 差异基因的GO分析80-81
  • 3.7.5 差异基因的KEGG富集及信号通路分析81-85
  • 3.7.6 差异基因的聚类分析85
  • 3.8 DHAV的干扰素信号通路初探85-92
  • 3.8.1 DHAV-1L感染DEF后的干扰素mRNA检测85-86
  • 3.8.2 DHAV感染DEF后的ELISA检测86-90
  • 3.8.3 DHAV-1L感染DEF后的ISGs检测90-92
  • 4 讨论92-99
  • 4.1 DHAV 3’UTR对病毒增殖和毒力的影响92-94
  • 4.2 基于RNA-seq的DHAV-1 感染DEF的模式识别受体信号通路94-96
  • 4.3 DHAV-1 感染宿主细胞DEF后的干扰素通路初探96-99
  • 5 结论99-100
  • 参考文献100-119
  • 攻读博士学位期间发表论文情况119-121
  • 致谢121

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