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《山东农业大学》 2017年
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鸭坦布苏病毒诱导的宿主天然免疫反应及与RLR信号通路的互作研究

李宁  
【摘要】:鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)是一种有囊膜的,单股正链RNA病毒,属于黄病毒科黄病毒属。DTMUV于2010年首先在福建、浙江等地的发病鸭场中分离到,主要引起产蛋鸭群产蛋下降、商品肉鸭生长迟缓和神经症状。该病传播迅速,给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。宿主天然免疫反应在病原微生物感染早期发挥重要作用,模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)作为宿主天然免疫系统的关键组成元件,主要识别病原微生物的保守成分。RIG-I样受体(RIG-I like receptor,RLR)是主要分布于非免疫细胞中的一类胞浆PRRs,包含维甲酸诱导基因I(retinoic acid induced gene-I,RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因(melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)以及遗传和生理学实验基因2(laboratory of genetics and physiology-2,LGP2),主要识别RNA病毒,通过接头分子线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS),启动下游信号级联反应,合成一系列的细胞因子,如I型干扰素和炎性细胞因子等,使宿主建立抗病毒天然免疫状态。目前,对DTMUV的致病性还不清楚,DTMUV感染后诱导的宿主天然免疫反应以及RLR在病毒感染过程中的作用更是缺乏了解。本研究以樱桃谷雏鸭为实验动物,通过病理组织学分析、荧光定量PCR等方法,首先观察DTMUV对不同日龄樱桃谷鸭的致病性差异,以及感染后诱导的天然免疫反应,然后使用过表达、RNA干扰和双荧光素酶报告基因检测等方法对RIG-I、MDA5和MAVS在病毒感染过程中的作用进行分析,初步探讨了DTMUV对RLR信号通路的抑制作用。研究内容主要分为以下四个方面:1.DTMUV对不同日龄樱桃谷鸭的致病性研究1、3和7周龄的樱桃谷鸭通过腿部肌肉注射途径感染DTMUV,然后观察感染鸭的临床症状、病理组织学变化、组织含毒量以及血清中和抗体等变化规律。结果发现,1周龄雏鸭在感染后第2天出现明显的以神经紊乱为主的临床症状,在感染后第5-7天,部分感染鸭死亡。3周龄感染鸭表现类似但程度较轻的临床症状,且未见死亡。而7周龄感染鸭仅出现一过性的食欲减退。实验鸭主要组织的病变程度随着感染日龄的增大而逐渐减轻。1周龄感染鸭出现明显的心内膜出血、脾肿大,回肠淋巴组织集中处黏膜肿胀,肝、肾肿胀且有出血,脑膜充血。3周龄感染鸭的病变程度较轻微,7周龄鸭则未见明显的眼观病变。但是,病理组织学分析显示,三组感染鸭均呈现典型的病毒性脑炎病变。组织中病毒含量检测发现,感染后第1天,DTMUV即能在1周龄感染鸭的大脑中检测到,感染后第3-5天,1周龄鸭的主要组织含毒量均显著高于另外两组感染鸭对应组织的含毒量(P0.05)。感染鸭血清中IFN-γ、IL-2及中和抗体的含量呈相似性变化,但1周龄鸭与另外两组鸭存在显著性差异(P0.05)。更重要的是,尽管各组实验鸭的血清中和抗体在DTMUV感染后第7-19天无显著差异,但是1周龄鸭的病毒清除速度却显著慢于3、7周龄鸭,表明与鸭日龄相关的自身免疫系统即天然免疫在感染早期清除病毒的过程中发挥关键作用。总的来说,本部分研究证实DTMUV对不同日龄鸭的致病性不同,日龄越小致病性越强,与日龄相关的免疫反应能力对DTMUV的致病性具有重要影响。2.DTMUV感染雏鸭和鸭胚成纤维细胞(DEFs)后诱导的天然免疫反应为确定DTMUV感染后诱导的天然免疫反应,我们通过相对荧光定量PCR检测了病毒感染1周龄雏鸭脾和脑组织中天然免疫相关基因的变化。结果显示,在DTMUV感染的早期阶段,病毒能显著上调RIG-I、MDA5和TLR3的表达(P0.05),说明这些PRRs参与DTMUV感染后诱导的天然免疫反应。同时,炎性细胞因子(IL-1β、L-2、IL-6和IL-8)和抗病毒蛋白(Mx、OAS等)也大量表达,其中IL-6表达量的增加最为显著。在感染鸭的脾和脑中,I型和II型IFNs的变化不同。在脾中,两种类型IFNs均呈现不同程度的上调,但是在脑中,二者变化趋势差异较大。除此之外,我们还检测了DTMUV体外感染DEFs后RIG-I、MDA5、I型IFNs和部分促炎细胞因子的表达变化,结果与体内实验类似,RIG-I和MDA5被病毒激活而过量表达,导致IFN-α和IFN-β、抗病毒蛋白OAS以及IL-6、IL-8等的大量表达。上述研究结果说明,DTMUV感染雏鸭和DEFs后其抗病毒天然免疫反应被迅速激活,但仍不足以抵抗病毒短时间内快速、大量的增殖,同时,促炎细胞因子如IL-6等的大量产生亦能对宿主自身造成一定的免疫损伤,从而加重病情。3.RIG-I和MDA5参与宿主的抗DTMUV感染为了进一步明确RIG-I和MDA5在抗DTMUV感染过程中的作用,使用过表达和双荧光素酶报告基因检测等技术分析了病毒感染DEFs后二者介导的IFN-β的产生情况。首先通过前期的实验,我们发现DTMUV能诱导RIG-I、MDA5、MAVS和IFN-β在m RNA水平上显著上调。进一步地,先在DEFs上分别过表达RIG-I和MDA5的全长及其效应结构域,再感染DTMUV,发现两个受体及其效应结构域均能抑制DTMUV增殖。继而,我们克隆并表达了鸭MAVS基因(du MAVS),通过过表达和RNA干扰证实,du MAVS在DTMUV感染过程中是必须的。此外,DTMUV感染后能进一步刺激RIG-I和MDA5诱导的转录因子NF-κB和IRF-7的产量,说明过表达的RIG-I和MDA5识别DTMUV核酸后能通过NF-κB和IRF-7信号通路激活下游IFN-β。本部分研究初步确定RIG-I/MDA5-MAVS-IRF-7/NF-κB信号通路介导IFN-β参与抗DTMUV的天然免疫反应。4.DTMUV的非结构蛋白NS1抑制RIG-I和MDA5介导的信号通路前期发现预先感染了DTMUV的细胞,再次经RIG-I或MDA5刺激后,其诱导的IFN-β表达量显著低于对照组细胞,提示DTMUV对RIG-I和MDA5介导的IFN-β的产生存在一定的抑制作用。为了进一步明确DTMUV通过何种方式拮抗宿主IFN-β的产生,我们分别克隆并构建了病毒7个非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的真核表达质粒,实验发现,过表达有NS1蛋白的细胞中IFN-β含量较对照组显著下降,表明DTMUV的NS1蛋白在拮抗RIG-I和MDA5的信号通路中起主要作用。进一步地,将NS1和du MAVS的真核表达质粒共转染DEFs,转染后24 h,通过激光共聚焦观察发现,DTMUV的NS1和du MAVS在细胞中存在共定位现象,初步确定DTMUV的NS1蛋白可能是通过与du MAVS的相互作用抑制了RLR信号通路。但是,此部分结果还需要通过免疫共沉淀等试验进行进一步的验证。
【关键词】:鸭坦布苏病毒 天然免疫反应 RIG-I样受体 相互作用 致病性
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 符号说明6-14
  • 中文摘要14-17
  • Abstract17-21
  • 1. 引言21-36
  • 1.1 鸭坦布苏病毒的概述21-22
  • 1.2 DTMUV的分子生物学特性22-26
  • 1.2.1 DTMUV的形态结构22
  • 1.2.2 DTMUV基因组特征和编码蛋白特点22-25
  • 1.2.3 DTMUV的细胞内的复制25-26
  • 1.2.4 DTMUV的理化特性及培养特性26
  • 1.3 DTMUV的研究进展26-28
  • 1.4 天然免疫概述28-31
  • 1.5 RLRS信号通路研究进展31-35
  • 1.5.1 RLRS家族成员概述31-33
  • 1.5.2 RLRS介导的信号转导33-35
  • 1.6 研究的目的意义35-36
  • 2. 材料和方法36-59
  • 2.1 试验材料36-44
  • 2.1.1 病毒株及抗体36
  • 2.1.2 试验动物及细胞36
  • 2.1.3 载体与质粒36
  • 2.1.4 引物及干扰分子36-41
  • 2.1.5 主要试剂及试剂盒41
  • 2.1.6 主要缓冲液及试剂的配制41-42
  • 2.1.7 主要仪器设备42-44
  • 2.1.8 分子生物学分析软件44
  • 2.2 试验方法44-59
  • 2.2.1 DMTUV对不同日龄鸭的致病性研究44-53
  • 2.2.1.1 DTMUV的增殖44
  • 2.2.1.2 DTMUV含量测定44-45
  • 2.2.1.3 动物实验设计45
  • 2.2.1.4 组织病理学检测45-46
  • 2.2.1.5 RNA提取及cDNA合成46-47
  • 2.2.1.6 质粒标准品的制备47-50
  • 2.2.1.6.1 DNA片段纯化回收47-48
  • 2.2.1.6.2 目的片段与T载体的连接48-49
  • 2.2.1.6.3 连接产物的转化49
  • 2.2.1.6.4 阳性克隆的鉴定及质粒提取49-50
  • 2.2.1.6.5 质粒浓度的测定50
  • 2.2.1.7 DTMUV增殖检测50-51
  • 2.2.1.8 血清中IFN-γ和IL-2 检测51-52
  • 2.2.1.9 血清中和抗体的检测52-53
  • 2.2.2 DTMUV感染诱导的天然免疫反应研究53-54
  • 2.2.2.1 鸭胚成纤维细胞(DEFs)的制备53
  • 2.2.2.2 动物实验设计53-54
  • 2.2.2.3 细胞因子检测54
  • 2.2.3 RIG-I和MDA5介导的抗DTMUV研究54-56
  • 2.2.3.1 鸭MAVS基因表达载体的构建54
  • 2.2.3.2 序列分析54
  • 2.2.3.3 荧光定量检测duMAVS的组织分布54
  • 2.2.3.4 质粒转染54-55
  • 2.2.3.5 间接免疫荧光55
  • 2.2.3.6 双荧光素酶报告实验55-56
  • 2.2.3.7 duMAVS的抗病毒实验56
  • 2.2.4 DTMUV对RIG-I和MDA5介导的抗病毒信号通路的拮抗作用56-59
  • 2.2.4.1 DTMUV各非结构蛋白的克隆表达56-57
  • 2.2.4.1.1 DTMUV各非结构蛋白真核表达质粒的构建56-57
  • 2.2.4.1.2 DTMUV各非结构蛋白真核表达质粒的表达57
  • 2.2.4.2 Western blot57-58
  • 2.2.4.2.1 样品准备58
  • 2.2.4.2.2 印迹分析58
  • 2.2.4.3 双荧光素酶报告基因实验58-59
  • 2.2.4.4 激光共聚焦实验59
  • 2.2.5 统计分析59
  • 3. 结果与分析59-89
  • 3.1 DTMUV滴度测定及其标准曲线的构建59-61
  • 3.1.1 DTMUV的TCID50测定59-60
  • 3.1.2 DTMUV荧光定量标准曲线的建立60-61
  • 3.2 DTMUV对不同日龄鸭的致病性研究61-69
  • 3.2.1 DTMUV感染鸭的临床症状及剖检病变61-62
  • 3.2.2 DTMUV感染鸭的病理组织学分析62-66
  • 3.2.3 组织载毒量检测66-67
  • 3.2.4 DTMUV感染鸭血清IFN-Γ和IL-2 检测67-68
  • 3.2.5 DTMUV感染鸭血清中和抗体检测68-69
  • 3.3 DTMUV诱导的天然免疫反应研究69-74
  • 3.3.1 DTMUV感染3周龄雏鸭后诱导的天然免疫反应研究69-72
  • 3.3.1.1 DTMUV感染鸭脾脏和大脑PRRs的检测69-70
  • 3.3.1.2 DTMUV感染鸭脾脏和大脑IFNs及ISGs的检测70-71
  • 3.3.1.3 DTMUV感染鸭脾脏和大脑细胞因子的检测71-72
  • 3.3.2 DTMUV感染鸭胚成纤维细胞(DEFs)后诱导的天然免疫反应研究72-74
  • 3.3.2.1 DTMUV感染DEFs后PRRs的检测72-73
  • 3.3.2.2 DTMUV感染DEFS后I型IFNs及ISGs的检测73
  • 3.3.2.3 DTMUV感染DEFs后细胞因子的检测73-74
  • 3.4 RIG-I和MDA5介导的信号通路参与抗DTMUV感染74-86
  • 3.4.1 RIG-I和MDA5及其效应结构域真核表达载体的构建74-75
  • 3.4.2 过表达RIG-I、MDA5及其效应结构域抑制DTMUV的复制75-76
  • 3.4.3 RIG-I和MDA5通过NF-κB和IRF7参与抗DTMUV感染76-77
  • 3.4.4 MAVS蛋白在RIG-I和MDA5介导的抗DTMUV感染过程中的作用研究77-86
  • 3.4.4.1 duMAVS基因的克隆及序列分析77-80
  • 3.4.4.2 duMAVS在健康鸭中的组织分布及病毒感染鸭中的duMAVS的表达分析80-81
  • 3.4.4.3 duMAVS的功能特点81-82
  • 3.4.4.4 在DEFs上过表达duMAVS蛋白后诱导的细胞因子和ISGs82-83
  • 3.4.4.5 duMAVS的抗病毒活性研究83-84
  • 3.4.4.6 duMAVS敲弱后能抑制polyI:C诱导的IFN-β84-85
  • 3.4.4.7 duMAVS敲弱后能抑制细胞因子产量及其抗病毒活性85-86
  • 3.5 DTMUV非结构蛋白NS1对RIG-I和MDA5介导的信号通路的拮抗作用86-89
  • 3.5.1 DTMUV非结构蛋白的克隆表达86-88
  • 3.5.2 DTMUV的非结构蛋白NS1拮抗RIG-I和MDA5介导的信号通路88
  • 3.5.3 NS1可能通过与MAVS的相互作用拮抗RIG-I和MDA5介导的信号通路88-89
  • 4. 讨论89-96
  • 4.1 DTMUV对不同日龄鸭的致病性研究89-91
  • 4.2 DTMUV感染后诱导的天然免疫反应研究91-93
  • 4.3 RIG-I和MDA5介导的信号通路参与抗DTMUV免疫反应93-94
  • 4.4 DTMUV非结构蛋白NS1拮抗RIG-I和MDA5介导的免疫反应研究初探94-96
  • 5. 结论96-97
  • 参考文献97-113
  • 致谢113-114
  • 博士期间发表文章114-115

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