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《山东农业大学》 2017年
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基于噬菌体展示技术的有机磷农药多残留免疫分析研究

赵凤春  
【摘要】:有机磷农药(organophosphorus pesticides,OPs)是一类能够抑制胆碱酯酶活性,具有广谱杀虫性和较低稳定性的农药,在我国农业生产中使用很广泛。但是,大量使用有机磷农药造成的食品和环境中有机磷农药的残留,对人们的身体健康构成了严重的威胁。免疫分析法是一种快速、灵敏、简便并且成本较低的检测方法,适用于农药残留样品的日常高通量检测的需要。由于有机磷农药种类较多,且多采用混配的方式使用,因此,制备有机磷农药的宽谱特异性抗体并建立有机磷农药多残留免疫分析方法是十分必要的。在本研究中,我们首先设计并合成了一系列有机磷农药的通用结构半抗原,然后将半抗原偶联载体蛋白合成了人工免疫原和包被原。一方面,利用合成的免疫原免疫BALB/C小鼠,并制备了两种有机磷农药宽谱特异性单克隆抗体,然后利用单克隆抗体和相应的最佳包被原建立了有机磷农药多残留免疫分析方法。另一方面,通过构建噬菌体单链抗体文库,利用噬菌体展示技术筛选获得了一种有机磷农药宽谱特异性单链抗体,并建立了一种基于单链抗体有机磷农药多残留的免疫分析方法。此外,本研究还以制备的单克隆抗体为靶标,利用噬菌体展示技术筛选获得了其抗原模拟表位,并通过原核表达制备了模拟表位融合蛋白,最后利用制备的模拟表位融合蛋白建立有机磷农药多残留的免疫分析方法。主要结果如下:(1)根据有机磷农药的通用结构,共设计合成22种有机磷农药通用结构半抗原(Hapten 1~Hapten 22),并利用核磁共振氢谱分析对半抗原进行结构鉴定。利用活化酯法,将半抗原Hapten 1(O,O-二乙氧基O-(3-羧苯基)硫代磷酸酯)和Hapten 2(O,O-二甲氧基O-(3-羧苯基)硫代磷酸酯)分别与BSA偶联制备了两种免疫原(Hapten 1-BSA和Hapten 2-BSA)。另外,将Hapten 1~Hapten 22分别与OVA偶联制备了22种候选包被原(Hapten 1-OVA~Hapten 22-OVA)。(2)使用Hapten 1-BSA免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤及单克隆抗体技术制备了有机磷农药的宽谱特异性单克隆抗体MAb3A7。以MAb3A7为靶标,对22种候选包被原进行筛选,结果表明Hapten 22-OVA为最佳包被原。利用MAb3A7和Hapten 22-OVA建立了有机磷农药多残留的间接竞争ELISA(IC-ELISA)检测法。交叉反应及灵敏度实验结果显示,所建立的IC-ELISA能够识别15种O,O-二乙氧基类有机磷农药和15种O,O-二甲氧基类有机磷农药。在最佳ELISA条件下,30种有机磷农药的IC_(50)值为23.1~899.9ng/m L,检测限为5.7~319.2ng/m L。对样品进行检测时,利用分散固相萃取法(d-SPE)对样品萃取液进行净化。实验结果表明,d-SPE净化处理能有效消除样品的基质对ELISA的影响。利用所建立IC-ELISA测定样品的单种农药添加回收率为89.4%~131.5%,变异系数为3.5%~15.7%。(3)使用Hapten 2-BSA免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤及单克隆抗体技术制备了有机磷农药的宽谱特异性单克隆抗体MAb3C9。将MAb3C9与辣根过氧化物酶(HRP)偶联制备了酶标单克隆抗体(MAb3C9-HRP)。以MAb3C9为靶标,对22种候选包被原进行筛选,结果表明Hapten 5-OVA为最佳包被原。使用MAb3C9-HRP和Hapten5-OVA建立了有机磷农药多残留的直接竞争ELISA(DC-ELISA)检测法。交叉反应及灵敏度实验结果显示,该方法具有O,O-二甲氧基类有机磷农药特异性,在最佳ELISA条件下,18种O,O-二甲氧基有机磷农药的IC_(50)值为1.3~231.0ng/m L,检测限为0.3~52.4ng/m L。利用所建立DC-ELISA测定样品的农药添加回收率为90.3%~112.8%,变异系数为3.5%~14.1%。(4)选取Hapten 1-BSA免疫后血清效价较高的BALB/C小鼠,提取其脾细胞总RNA,并通过反转录制备了cDNA。以cDNA为模板,PCR扩增获得抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,然后通过SOE-PCR将VH、VL组装获得了单链抗体(scFv)全长基因。将scFv基因与噬粒p IT2-BAD连接后转化E.coli TG1制备了单链抗体库(库容为5×10~7)。对经KM13辅助噬菌体拯救获得的噬菌体展示单链抗体库进行四轮淘选,经过淘选,阳性噬菌体被大量富集。然后利用phage-ELISA筛选第四轮中的单克隆噬菌体,获得了有机磷农药宽谱特异性单链抗体scFv-5。单链抗体以包涵体形式在E.coli BL21(DE3)中大量的表达,经过复性、生物素化及纯化后,获得生物素化的有机磷农药宽谱特异性单链抗体,产量为66.7mg/L。利用生物素化scFv-5-BAD和Hapten 22-OVA建立有了机磷农药多残留的IC-ELISA检测法。交叉反应结果显示该方法能够同时检测多种O,O-二乙氧基类有机磷农药和O,O-二甲氧基类有机磷农药。在最佳ELISA条件下,30种农药的IC_(50)值为19.4~515.2ng/m L,检测限为4.1~90.7ng/mL。利用所建立的IC-ELISA测定样品的农药添加回收率为88.9%~117.6%,变异系数为3.8%~16.7%。(5)为获得MAb3A7的噬菌体模拟表位,以MAb3A7为靶标,对噬菌体展示随机环七肽库进行了三轮淘选来富集阳性噬菌体。利用竞争性phage-ELISA对第三轮的噬菌体单克隆进行筛选,并获得单克隆抗体MAb3A7的最佳模拟表位ME13(C-M-S-W-L-G-W-A-C)。将ME13与GST及BAD进行融合表达,表达产物经过体外生物素化及纯化后获得了生物素标记的模拟表位融合蛋白ME13-GST-BAD。利用生物素化的ME13-GST-BAD和MAb3A7建立了有机磷农药多残留的DC-ELISA检测法。在最佳ELISA条件下,该方法对30种有机磷农药的IC_(50)值为8.2~402.5ng/mL,检测限为2.3~127.7ng/m L。利用所建立的DC-ELISA测定样品的农药添加回收率为91.3%~120.3%,变异系数为3.2%~12.3%。(6)以MAb3C9为靶标,经过对噬菌体展示随机环七肽库的三轮淘选及对噬菌体单克隆的筛选,获得了MAb3C9的最佳模拟表位ME20(C-T-G-T-T-P-F-Y-C)。模拟表位以ME20-GST-BAD融合蛋白形式过表达,再经过体外生物素化及纯化后获得了生物素标记的模拟表位融合蛋白ME20-GST-BAD。利用生物素化ME20-GST-BAD和MAb3C9建立了有机磷农药多残留的DC-ELISA检测法。在最佳ELISA条件下,该方法对18种O,O-二甲氧基有机磷农药的IC_(50)值为1.5~294.9ng/m L,检测限为0.3~63.2ng/m L。利用所建立的DC-ELISA测定样品的农药添加回收率为92.4%~121.5%,变异系数为2.9%~13.6%。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S481.8

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