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《山东农业大学》 2020年
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BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究

王芹  
【摘要】:提高家蚕的产丝量是蚕丝业几千年来一直追求的目标。家蚕的丝腺是合成和分泌蚕丝蛋白的器官,是整个蚕丝业的生物学基础。因此,探明家蚕丝腺形成和发育的分子调控机制具有重要的理论意义和实践意义。Slit是一类在进化上高度保守的分泌型糖蛋白,它与受体Roundabout(Robo)在神经轴突导向、神经元的迁移、血管生成、癌细胞转移、白细胞趋化等多种生理病理过程中具有调节作用。家蚕丝腺被认为是果蝇唾液腺的进化同源器官。现有研究发现,Slit及其受体Robo在果蝇唾液腺发育中发挥着重要作用,但是在家蚕丝腺中的功能研究还未有相关报道。Tbx20是一种进化上高度保守的转录因子,是T-box转录因子家族成员之一,在调控心脏发生、控制细胞迁移、促进细胞增殖等过程中扮演着重要角色。在果蝇胚胎发育过程中,Tbx20的同源基因midline能够调控唾液腺的导向迁移,也可以同时调控神经系统中slit和robo基因的表达,但对于Tbx20在家蚕中的功能目前还不清楚。本研究基于前期在家蚕中已鉴定并克隆的Bmslit和Bmrobo(Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3)以及Bmtbx20基因,通过qPCR和免疫荧光染色确定Bmslit、Bmrobo及Bmtbx20基因在丝腺中的时空表达模式,探讨它们在丝腺发育中的功能,并在胚胎期采用RNAi技术,分析BmTbx20对Bmslit和Bmrobo基因的表达调控作用及对丝腺发育的影响,以期为揭示家蚕丝腺发生和发育的基因调控网络提供新的资料。主要研究结果如下:1.利用qPCR技术,系统检测了家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的表达变化。结果表明,Bmslit和3个Bmrobo基因在家蚕前、中、后部丝腺中均有表达,而且在不同发育时期存在很大差异,但Bmslit和Bmrobo的表达特征具有较高的相似性和关联性。2.通过免疫荧光染色对BmSlit和BmRobo蛋白进行双染,发现BmRobo1a、BmRobo1b、BmRobo2/3与BmSlit在家蚕胚胎以及幼虫不同发育时期、不同功能区的丝腺细胞质中均有合成,而且在幼虫丝腺细胞膜处都存在共定位。说明BmSlit可能通过与BmRobo结合而在家蚕丝腺中发挥作用。3.分别将Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的siRNA注射到丝腺发生前的蚕卵中进行RNA干涉。qPCR检测发现,注射48 h后的蚕卵中以上4种基因的表达均被不同程度抑制,相对表达量都比对照组极显著下调。4.取家蚕不同发育时期的丝腺组织,通过qPCR和免疫荧光染色分别从转录水平和蛋白水平上分析了Bmtbx20基因在丝腺中的时空表达模式。结果表明,Bmtbx20在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期均有表达,转录因子BmTbx20与BmSlit在家蚕胚胎期和幼虫期丝腺中均有合成。5.对家蚕17-18期胚胎中的Bmtbx20基因进行RNAi,qPCR测定显示,蚕卵注射后48 h,不仅Bmtbx20的相对表达量与对照组NC相比极显著下降,而且Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的相对表达量也都存在不同程度的下调。这些结果表明,转录因子BmTbx20可能通过调控Bmslit和Bmrobo基因的表达从而调控丝腺的发育过程。6.在家蚕胚胎期对Bmslit、Bmrobo以及Bmtbx20基因进行RNAi,与对照组NC相比,Bmslit和Bmrobo基因RNAi后,丝腺的发生位置及丝腺发育情况均未见明显差异。但Bmtbx20基因RNAi后会导致胚胎发育加快,丝腺发育也相应提前,故在同一催青时间,丝腺较对照组延伸的较长。关于这些基因在丝腺发育中的详细作用机理还有待利用基因敲除等手段做进一步研究。
【学位授予单位】:

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1 王芹;BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究[D];山东农业大学;2020年
2 梁晓;家蚕T-box基因Bmtbx20与Bmtbx1的功能研究[D];山东农业大学;2015年
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