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《山东农业大学》 2020年
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家蚕人工饲料摄食性相关的lncRNA分离与鉴定

李鲁秦  
【摘要】:家蚕(Silkworm,Bombyx mori)是鳞翅目昆虫发育及生理学特征研究的模式生物,作为寡食性的经济昆虫,研究其摄食性具有重要理论及应用价值。家蚕的摄食性研究主要在于家蚕对人工饲料的摄食性,摄食性较好的家蚕品种一般具有抗性强、生长发育快、熟蚕体重大等优良特性,对蚕业生产意义重大。家蚕摄食性遗传研究相对较多,但分子生物学水平上的摄食性差异机制尚不十分清楚,对其相关的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)完全未知。因此,研究探索与家蚕摄食性相关的lncRNA,解析其在家蚕摄食过程中的调控机制,将为家蚕摄食性的遗传改良提供新的思路。本文以经过歧化选择的、对人工饲料摄食性好的菁松B高食(JBH)和摄食性差的菁松B低食(JBL)家蚕为研究对象,构建cDNA文库并进行高通量测序分析,筛选差异表达的lncRNAs,基于lncRNA与靶基因的作用方式来预测具有顺式作用(cis)或反式作用(trans)的靶基因,并进行GO和KEGG功能分析与鉴定,通过对其的初步验证及功能预测,研究lncRNA对家蚕摄食性的影响,以期为家蚕食性相关基因改良提供理论依据。主要研究结果如下:1、构建了不同人工饲料摄食性家蚕的cDNA文库,共完成71.38 Gb Clean Data的数据分析,各样品分析均达到11.08 Gb,Q30碱基百分比在92.24%及以上。通过对转录组测序分析,共鉴定到11759个mRNAs,发现有122个mRNAs在不同人工饲料摄食性的家蚕中表达差异,其中在JBH中上调的有47个,下调的有75个;共鉴定到2373个lncRNAs,表达差异的有267个,其中在JBH中上调的有152个,下调的有115个。运用生物信息学分析方法,在差异表达的mRNAs和lncRNAs中有623对被预测存在顺、反式作用,其中48对与家蚕食性相关。2、对差异表达基因进行生物信息学分析,筛选出了差异最为显著的可能和家蚕摄食性相关的8个lncRNAs及与其有相互作用的4个mRNAs,利用荧光定量PCR鉴定了8个lncRNAs和4个mRNAs的表达。结果表明,不同基因在家蚕中差异表达,同一基因在不同人工饲料摄食性的家蚕中表达量不同,同一基因在家蚕中的不同发育时期或不同组织中的表达量也不同。这在一定程度上也表明了家蚕对人工饲料摄食性的复杂性。3、荧光定量PCR鉴定分析发现,有3对(BmGR31-lnc582与BmGR31、BmGR67-lnc491与BmGR67、BmOBP3-lnc961与BmOBP3)存在顺式作用的lncRNA与mRNA在家蚕发育过程中的表达呈现相反的趋势,有1对(BmOR42-lnc272与BmOR42)存在反式作用的lncRNA与mRNA在家蚕发育过程中的表达呈现相同的趋势,预测lncRNA可能负向调节或者正向调节mRNA的表达。4、通过PCR克隆得到了BmGR67-lnc491,构建了其lncRNA的过表达载体,命名为pcDNA3.1-BmGR67_lnc491,同样PCR扩增回收BmGR67基因的启动子,构建了带有荧光素酶报告基因的表达载体,命名为pGL3-Basic-BmGR67。利用细胞转染技术将pcDNA3.1-BmGR67_lnc491和pGL3-Basic-BmGR67共转染HEK293T细胞,荧光素酶报告系统检测BmGR67启动子活性,结果发现,BmGR67启动子活性下降60%,表明BmGR67-lnc491可显著抑制BmGR67基因启动子的活性,也进一步证明了BmGR67-lnc491负向调节BmGR67基因的表达。
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