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《山东农业大学》 2020年
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母源因子Patl2对体细胞重编程的影响

曹淑媛  
【摘要】:自从2006年日本京都大学Shinya Yamanaka实验室发现可以用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四因子将体细胞诱导为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)以来,体细胞重编程技术已经得到了很大的发展,但仍然存在着效率低、诱导时间长和安全性差等各种问题。体细胞核移植及早期胚胎发育研究表明,卵母细胞质中特异存在的母源因子启动胚胎的早期发育,激活基因组转录并合成表达新的基因,最后产生级联反应以维持胚胎的持续发育,这些因子可以提高早期胚胎发育及重编程的效率。而存在于雄性原核中的父源性因子也是早期胚胎发育和核移植的重要因素,研究表明在核移植过程中融合一个额外的雄原核可以显著提高核移植胚胎的囊胚率。这些研究进一步证实了卵母细胞质和雄性原核中存在的关键因子可以促进重编程。本研究的目的是筛选出促进重编程的母源或者父源因子,并对产生的iPS细胞系进行鉴定,而后对其促进重编程的机制进行探究。首先,我们根据已报道的早期胚胎蛋白质组数据,筛选了Patl2、Grn、Pdha1、Faf1、Dhodh、Lman1 6个在卵母细胞质及雄性原核中高表达的因子,构建了6个基因的Dox诱导型过表达载体,并以经典的四因子诱导为基础,检测了6个因子对小鼠成纤维细胞(MEF)重编程的影响。我们以Oct4-GFP/Rosa26-M2rtTA转基因小鼠的成纤维细胞为源头细胞进行筛选,结果发现,在6个筛选因子中,过表达母源因子Patl2及Grn、Faf1都可以提高体细胞重编程的诱导效率。其中,又以过表达Patl2对重编程的促进作用最为显著。在重编程结束后收样进行流式检测发现,过表达Patl2产生Oct4-GFP~+细胞数量与对照组Vector相比高出15倍,多能基因Oct4的表达是细胞完全重编程的标志,说明Patl2的参与让更多的成纤维细胞重编程为具有多能性的诱导多能干细胞。同时碱性磷酸酶染色(AP染色)结果显示的克隆数量也明显增多,过表达Patl2产生的克隆数量是对照组的12倍。并且在重编程过程中Patl2的参与可以加快克隆出现的时间。为了进一步确定Patl2对重编程的作用,在诱导结束后我们挑取单个克隆建立了OSKM+Patl2-iPS细胞系。研究发现,该细胞系具有与胚胎干细胞类似的形态特征,并且由于带有GFP标签的多能基因Oct4的表达而呈现出绿色荧光。接下来,我们在RNA水平上也验证了这一观点,通过对OSKM+Patl2-iPS细胞系多能基因检测发现,多能性基因Oct4、Sox2、Nanog等在所建立的iPS细胞系中高表达,且显著高于源头细胞MEF。这个结果同样在蛋白水平上得到了印证,我们选择了3个多能性的标志蛋白NANOG、SOX2、SSEA1进行了细胞系的免疫荧光染色,选取的OSKM+Patl2-iPS细胞系均呈现红色荧光,证明相应的多能蛋白表达。此外,我们又在分化潜能等方面对细胞系进行了验证。首先对过表达Patl2参与建立的细胞系进行了核型检测,确保核型正常。之后采用悬滴法模拟胚胎环境进行拟胚体(EB)实验,实验证明OSKM+Patl2-iPS细胞系均可在体外分化形成EB,这些EB球在贴壁后,定量检测发现内胚层标志基因Gata6、Sox17,中胚层标志基因Nkx2.5、Brachy,外胚层标志基因Fgf5、Kdr,滋养层标志基因Eomes、Cdx2的表达升高,证明产生的拟胚体可以随机向内胚层、中胚层、外胚层三个胚层分化。在嵌合体实验中,受体胚胎的生殖嵴上可以产生具有Oct4-GFP绿色荧光的OSKM+Patl2-iPSC嵌合,证实了OSKM+Patl2-iPS真正具有全能性。为了探究Patl2促进重编程的具体机制,对重编程第3天、出现克隆(11±2天)及大量出现克隆(15±2天)3个时间点的细胞进行了RNA-seq,测序结果的GO分析显示,过表达Patl2相较于对照组Vector表现出很大的基因差异,其中差异上调基因主要富集在转录、酰胺代谢、肽的合成加工、核糖体、有机氮复合生物合成过程中;差异下调的基因则在泛素蛋白转移酶活性、Ras GTPase结合、磷酸化、细胞粘附性、细胞周期上富集。KEGG通路富集结果显示Patl2过表达主要影响了核糖体及氧化磷酸化,相较于对照组Vector过表达Patl2上调了核糖体组成蛋白编码基因Rpl22、Mrpl34、Rps16等在内的22个基因的表达。总之,我们的研究发现了新的母源因子可以影响重编程。这种在卵母细胞质中高表达的因子——Patl2可以提高重编程的诱导效率,其过表达产生的iPS细胞系可以表达多能性基因,具有正常的小鼠核型,在体外能够向三胚层随机分化并形成嵌合体。并且这些可能是通过Patl2影响转录及代谢来实现的。这些为发掘更高效安全的重编程途径提供了一条新的思路。同时,新因子的发现更加丰富了重编程的方法和机制,增强了研究早期胚胎发育的重要内涵。
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1 曹淑媛;母源因子Patl2对体细胞重编程的影响[D];山东农业大学;2020年
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