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《山东农业大学》 2020年
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基于电化学免疫传感技术的家蚕核型多角体病毒检测方法研究

宋贵珍  
【摘要】:家蚕核型多角体病,又名家蚕血液型脓病,一直是蚕业生产中危害最为严重的病毒性传染病,及时采取有效的防控措施,是防止群体内蚕病大流行或避免蚕病爆发造成经济损失的有效途径。传统家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,BmNPV)检测手段基本上都有一定的缺陷,研究建立一种快速、特异、简便的高灵敏BmNPV检测技术,减少家蚕核型多角体病对蚕茧生产造成的经济损失,保持蚕桑生产的可持续健康稳定发展具有重要意义。电化学免疫传感器具有操作简便、检测限低、精密度高、原料低廉、反应时间短、可自动化操作等优点,被成功应用于临床医学诊断、食品工业质检、环境成分分析、动物病原微生物检测等领域。本研究通过利用混合自组装膜修饰金电极,构建家蚕核型多角体电化学免疫传感器,建立家蚕核型多角体病毒电化学免疫传感器快速检测技术,并且应用到实际样品检测中。主要研究结果如下:1.对两种混合自组装膜进行电化学表征以及检测抗原效果的研究,结果表明80%的MUA/ME混合自组装膜修饰电极效果最佳。将预处理后的工作电极置于80%的MUA/ME混合溶液中进行自组装24 h,置入EDC/NHS混合溶液活化1 h,再逐步滴加多角体蛋白抗体、BSA、抗原等进行层层修饰,通过交流阻抗法与原子力显微镜对该免疫传感器制备过程进行表征。结果表明该免疫传感器阻抗值与电极表面的粗糙度随着电极的逐步修饰而增加,且其阻抗值的变化与电极上捕获的抗原浓度具有一定的线性关系,表明家蚕核型多角体病毒电化学免疫传感器构建成功。2.对构建的BmNPV电化学免疫传感器的检测条件进行优化,结果表明结合抗体稀释500倍时,电化学信号变化值达到最大,之后趋于平缓;抗体抗原孵育的最佳温度为37℃时,抗体抗原的反应活性最高,其阻抗值的变化最为明显;抗体抗原作用时间为30 min时,电化学信号达到最大,之后趋于平缓。3.对BmNPV电化学免疫传感器的检测性能进行研究,结果发现当多角体蛋白浓度在0.0001-100 ng/mL范围内,线性方程Y=4619.63 LgC+21018.36,检出限达到14.54fg/mL,线性相关系数平方(R~2)为0.9922,跨越了七个数量级,灵敏度较高。特异性测定试验结果表明,蚕血、家蚕质型多角体病毒等干扰物质的阻抗值变化远远低于检测抗原的响应值,说明传感器的特异性好,抗干扰能力强。重复性检测结果显示,其相对标准偏差均小于5%,表现出较好的准确性与精密度。再生性试验表明,该免疫传感器在0.2 mol/L甘氨酸-0.2 mol/L HCl(pH=2.4)的解离液中可反复再生5次左右,降低了实际应用成本。4.将BmNPV电化学免疫传感器用于实际样品检测,标准血清加入法实验结果显示,试验浓度的RSD值均小于10%,其回收率在92.31%-100.61%,说明该检测方法精密度较高,准确度良好,具有较高的潜在应用价值。采用添食法对家蚕进行攻毒,取感染不同时间的家蚕血液进行电化学免疫传感器检测(EIS法),结果表明家蚕在攻毒12 h时血液的检测阻抗值相较于攻毒0 h差异显著(P0.05),与PCR反应检测结果基本一致,但EIS法检测周期明显缩短,且检测步骤简单,为家蚕核型多角体病的早期检测提供了一种新的检测技术。
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