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《山东农业大学》 2020年
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桑椹不同发育时期DNA甲基化和转录组联合分析及bZIP60基因的功能研究

方立静  
【摘要】:DNA甲基化作为一种表观遗传机制,在基因表达调控中发挥重要作用,有研究表明DNA甲基化对果实的发育有一定的调控作用,但是其具体的作用及调控机制还不清楚。本研究对不同发育时期的桑椹进行了转录组测序和全基因组DNA甲基化测序(Methyl RAD-Seq)联合分析,筛选出了不同发育时期桑椹中DNA甲基化水平和表达量同时存在差异的基因,并对其中的Mul-b ZIP60基因的表达特性和生物功能进行了研究。研究结果为全面揭示桑椹发育过程中的分子调控机制奠定了基础,同时也为桑树遗传改良提供了候选基因,对于促进桑树功能基因组学研究具有重要意义。本研究的主要结果如下:(1)不同发育时期桑椹的转录组分析构建了果实膨大期青色桑椹(MG)、果实转色期红色桑椹(MR)和果实成熟期紫色桑椹(MP)的转录组测序文库并进行了测序分析,在MR和MG,MP和MG,MP和MR对比样本组中分别鉴定到2836、8760和6072个差异表达基因。通过KEGG分析发现这些差异表达基因功能主要被富集在碳代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基酸生物合成等代谢途径,另外,有较多基因被富集在苯丙酸和类黄酮的次生物质的代谢途径。根据差异表达基因在桑椹不同发育时期的表达模式,将其分为7个不同的clusters,在这7个clusters中有194个转录因子,93个参与激素代谢的基因,41个参与花青素合成的基因以及26个与DNA甲基化相关的基因。(2)不同发育时期桑椹的基因组DNA甲基化水平差异分析利用Methyl RAD-Seq技术对不同发育时期桑椹的基因组DNA甲基化差异进行了分析,在MR和MG,MP和MG,MP和MR对比样本组中分别鉴定出191、465和934个CCGG位点甲基化水平存在差异的基因,另外,还分别鉴定到166、421和668个CCWGG位点甲基化水平存在差异的基因,这些甲基化水平差异基因的甲基化差异位点多分布于基因间区和外显子区。根据不同发育时期基因的甲基化水平变化趋势,可以将在CCGG位点甲基化水平存在差异的基因分为8个clusters,在CCWGG位点甲基化水平存在差异的基因分为7个clusters,不同cluster中的基因主要被富集在MAPK信号传导、m RNA监测、嘌呤代谢等途径。这些clusters中包含有868个转录因子,218个参与激素代谢的基因,74个参与花青素合成的基因以及86个与DNA甲基化相关的基因。(3)不同发育时期桑椹的转录组和DNA甲基化水平联合分析将筛选出的DNA甲基化水平差异基因和m RNA差异表达基因进行联合分析,在MR和MG,MP和MG,MP和MR对比样本组中的差异表达基因中分别有101、827和1057个基因的CCGG位点甲基化水平存在差异;另外,还有35、445和512个基因的CCWGG位点甲基化水平存在差异。这些基因表达水平和甲基化水平同时存在差异的基因的甲基化差异位点主要分布在基因间区和外显子区,其功能主要被富集到转录、葡萄糖运输、ABA响应及黄酮类物质合成等代谢通路。(4)Mul-b ZIP60基因的功能研究从桑树中克隆得到Mul-b ZIP60基因,该基因编码的蛋白质包含330个氨基酸,定位于细胞质膜上。Mul-b ZIP60基因在桑树中不具有组织表达特异性,但在不同组织中的表达丰度存在显著差异;克隆得到了Mul-b ZIP60基因的启动子,该启动子序列中包含多种激素、光照、干旱、低温等响应元件,通过GUS组织化学染色法分析发现该启动子具有显著的ABA、SA和光照诱导表达活性。Mul-b ZIP60基因在拟南芥中表达可以促进转基因植株花青素的合成,增强ABA和干旱诱导的花青素的积累。(5)Mul-b ZIP60的互作蛋白筛选及鉴定利用酵母双杂交技术筛选出了15个可能与Mul-b ZIP60存在相互作用的蛋白质,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶B、F-box蛋白PP2-A13、组氨酸-精氨酸甲基转移酶1.4、枯草蛋白酶类似蛋白酶SBT1.4、钙调蛋白循环蛋白CP12-1、伴侣蛋白dna J A6、α-葡萄糖苷酶、b ZIP17转录因子、管腔结合蛋白5、60S核糖体L17-2、自主叶绿体相关蛋白、BTB/POZ结构域包含蛋白质、血红素结合蛋白2、乙醛脱氢酶3家族成员F1和Barwin蛋白。克隆出了桑树管腔结合蛋白5基因(Mul-LBP5),并利用酵母双杂交回复试验和双分子荧光互补试验验证了Mul-b ZIP60与Mul-LBP5蛋白的相互作用关系。
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