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猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及遗传进化分析

鞠泳政  
【摘要】:猪流行性腹泻病毒(Procine epidemic diaherra virus,PEDV)是猪病毒性腹泻爆发的主要病原之一,在感染仔猪后,会引起猪的流行性腹泻(Procine epidemic diaherra,PED)。哺乳期仔猪发病率及病死率极高。自2010年,PED在我国大面积爆发,因此对PEDV的流行情况进行持续的监测十分必要。本研究首先将PEDV N基因连接到p EASY-Blunt Simple载体,构建标准质粒。利用该质粒上的T7启动子,体外转录RNA模板作为荧光定量RT-PCR的标准品。对灵敏度的验证表明,本研究所建立的实时荧光定量PCR方法最低可以检测到10个拷贝。通过检测多种病毒,评估该方法的特异性及准确度,结果表明,仅PEDV可以扩增到曲线,而其他病原均无曲线扩增;无论是批内重复试验还是批间重复试验,其CT值的变异系数均在2%以下,表明该方法特异性强,准确度高。用建立好的RT-PCR方法对2018-2019年山东省四个地区采集的161份临床样品进行检测,阳性率在25.71-41.93%。这表明PEDV在本研究所取样地区猪群中的流行较为严重,对该病的防控工作刻不容缓。随后,本研究对山东部分地区PEDV流行株的S序列进行了扩增测序和比对分析,绘制遗传进化树。研究发现,本研究鉴定的毒株和近期中国某些地区分离的毒株亲缘关系密切,但本研究中所鉴定的6个毒株分处两个不同的群中,其中4株属于G2b型,1株属于G2a型,1株属于G1型。除了SDLY1801外,五株均和主要疫苗株亲缘关系较远,说明目前养殖场暴发的PEDV在流行过程中S基因序列发生了变异,极有可能导致现有疫苗失去保护作用。最终,本研究使用Vero细胞在病料中分离到一株PEDV流行株SDLY1801,该病料在Vero细胞上盲传5代,间接免疫荧光试验检测证实成功分离到PEDV毒株。根据参考毒株的基因组序列设计15对特异性引物,对PEDV SDLY1801株进行全基因组测序。测序结果表明,SDLY1801属于G1型,S基因没有发生插入或缺失突变,但存在较多变异,特别是在核心表位COE结构域存在氨基酸变异;对S基因的抗原指数进行分析,同样发现在20-100aa及300-350aa氨基酸SDLY1801株S蛋白和CV777株S蛋白的抗原性存在差别。这表明PEDV在流行过程中,不断发生突变,产生抗原性的改变。本研究也提示,尽管我国目前猪群PEDV感染以G2群为主,但仍不可以放松对G1群PEDV的防控力度。


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