一株新型E亚群禽白血病病毒的分离与鉴定

【摘要】：禽白血病(avian leukosis,AL)是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属的禽白血病病毒(avian leucosis viruses,ALVs)引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的一类可传染的肿瘤性疾病。ALVs为线性的单股正链RNA病毒,基因组长约7.0-7.8kb,基因组两端有长末端重复序列(LTR),为非编码区,中间为含有5’-gag–pol-env-3’顺序的结构基因,可编码多种蛋白。2019年,在没有外源性禽白血病病毒和任何其他致肿瘤病毒感染的情况下,从江苏一家商品蛋鸡场中发现了一起疑似禽白血病的肿瘤病例。本研究对该病例进行了病毒检测,进而对检测到的病毒做分离鉴定、全基因组序列测定与比较分析,确定引起该病的病原为一株重组E亚群禽白血病病毒(ALV-E)。本研究共分三部分:一、病料收集与病毒检测2019年12月,江苏一家蛋鸡场发生一起肿瘤性传染病,发病率为40%,病死率为10%,剖检时发现肝脏上有肿瘤。本研究设计了马立克病毒、禽白血病病毒、禽戊型肝炎病毒、网状内皮组织增生症病毒等鸡致肿瘤病毒的特异性检测引物,对可能引起该病的病原进行了检测。PCR检测和扩增产物的测序结果表明该鸡场发病可能是由ALV-E感染所致。二、病毒的分离与鉴定将病死鸡有明显肿瘤病变的肝脏组织研磨后接种到鸡胚成纤维细胞(CEF),连续传三代后收获细胞上清,使用商品化试剂盒进行ELISA检测p27抗原,并超速离心后进行病毒颗粒的电镜观察。同时原核表达该毒株的gp85蛋白免疫BALB/c小鼠制备单因子血清,以此血清进行CEF的间接免疫荧光检测(IFA)。检测结果表明引起该病的ALV可以在CEF上进行复制并形成完整的病毒粒子,将该病毒命名为JS1208。三、全基因组克隆测序及分析根据已发表的ALV-E的全基因组序列设计了七对特异性引物,进行JS1208毒株的全基因组克隆测序。另外设计两对引物,对其可能存在的特殊结构进行检测。测序结果表明,JS1208株ALV基因组全长为7524nt,全基因组核苷酸序列和囊膜蛋白基因(env)氨基酸序列系统进化分析表明,JS1208株ALV为一株ALV-E。长末端重复序列(LTR)的系统进化树分析结果表明,JS1208株(ALV-E)的LTR与K亚群ALV(ALV-K)GDFX0601株的LTR完全相同。利用RDPv.4软件分析显示:JS1208毒株是由E亚群的ev-1毒株和K亚群的TW-3593毒株重组而来。这是首次发现由ALV-E和ALV-K重组而来的ALV-E引起鸡场发生肿瘤性传染病并造成较为严重的临床危害,应当引起高度重视。