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鸭TRIM32的克隆、鉴定及其介导的抗鸭坦布苏病毒分析

胡晓芳  
【摘要】:我国是养鸭大国,近年来,鸭病毒病对我国的养鸭业造成了严重的危害,其中鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)导致的鸭坦布苏病毒病具有发病急,传播速度快的特点,是危害蛋鸭和肉鸭养殖较为严重的疫病。DTMUV属于黄病毒科、黄病毒属,为单股正链RNA病毒。TRIM32(Tripartite motif 32)是E3-泛素连接酶家族中的重要成员,于1995年被发现,由N端保守的RING、两个B-Box、Coil-coiled结构域和C端可变的结构域构成。TRIM32在哺乳动物和鱼类中的研究发现其具有调节中枢神经系统功能和抗病毒作用。但关于TRIM32在禽类抗病毒方面,尤其是在水禽方面的研究较少,为进一步了解TRIM32在樱桃谷肉鸭抗鸭坦布苏病毒病毒中的作用,本研究克隆了樱桃谷肉鸭TRIM32基因并分析了其对DTMUV的抑制作用及机制。研究内容有以下四个部分:第一部分樱桃谷肉鸭TRIM32基因的扩增根据NCBI上发布的鸭TRIM32基因的预测序列设计鉴定引物,提取健康樱桃谷肉鸭脾脏的RNA并反转录作为PCR扩增反应的模板,进行PCR反应从而获得目的基因片段。将目的片段电泳进行胶回收并测序,最终获得鸭TRIM32的基因序列。鸭TRIM32的CDs区大小为1950bp,编码649个氨基酸。系统进化树分析显示TRIM32与鸟类中的同源性较高,与爬行类动物同源性较低。第二部分检测樱桃谷肉鸭各组织中TRIM32的分布情况提取健康樱桃谷肉鸭的心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑、脑干、胸腺、胰腺、法氏囊、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、皮肤、肌肉、腺胃、肌胃、气管、食管等21个组织的RNA并反转录为c DNA作为模板,以回肠作为参比组织,利用荧光定量PCR技术来确定樱桃谷肉鸭的这21个组织中TRIM32的m RNA分布情况。由结果得知,TRIM32在气管中的表达量最高,是参比组织的34.3倍,在十二指肠、肺、皮肤、胰腺、肌肉、大脑、胸腺、法氏囊中表达量较高,而在空肠、脾、心中表达量相对较低。第三部分TRIM32的抗病毒作用及相关因子检测为探索TRIM32的抗病毒作用,本研究构建了TRIM32的真核表达载体并合成了针对TRIM32的干扰RNA,结果发现过表达TRIM32后病毒含量较空白对照组明显降低,敲低TRIM32则有相反的影响。在过表达TRIM32后感染DTMUV,荧光定量PCR结果显示IFN-α、IL-1β、RIG-I、Mx、OAS的表达量均上调,且在感染后12h最显著。其中IFN-α上调幅度最大,12h时IFN-α的表达量上调了16.9倍,Mx上调7.1倍、OAS上调13.2倍、RIG-I上调2.9倍、IL-1β上调2.4倍。敲低TRIM32则有相反影响,其中IFN-α下调最为显著。上述研究结果表明TRIM32能够增强DTMUV感染引起的鸭体内IFN-α和其他细胞因子的上调,可能在病毒感染的早期发挥抗病毒作用。第四部分鸭TRIM32原核表达载体的构建制备一种针对为鸭TRIM32的特异性抗体对于进一步对其功能进行研究是很有必要的,在本研究中成功构建了鸭TRIM32的原核表达载体,通过酶切、测序、SDS-PAGE等方式对其进行了验证。各项结果均表明,鸭TRIM32蛋白能够以原核表达的方式在BL21大肠杆菌中进行表达,这对今后制备针对鸭TRIM32的特异性抗体提供了一种有效的抗原制备方法。本项目从樱桃谷肉鸭中克隆获得了鸭TRIM32的全长CDs序列,通过同源性进化树分析,得知鸭TRIM32与鸟类同源性较高。健康鸭组织分布检测结果表明TRIM32在所有检测组织中广泛分布,其中气管是21个组织中表达量最高的组织。通过基因过表达与RNA干扰实验发现TRIM32可以显著降低DTMUV在DEF细胞中的复制,可以在DTMUV感染的早期促进DTMUV感染的DEF细胞中IFN-α、IL-1β、RIG-I、Mx、OAS的表达量的上调,而敲低TRIM32则有相反的影响。鸭TRIM32原核表达载体的构建及在BL21中的成功表达为今后对于其功能的深入研究提供了实验基础。总之,本研究的结果将有助于阐明TRIM32在水禽先天性免疫应答及抗感染机制,对预防和治疗水禽感染性疾病具有重要意义。


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