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《山东农业大学》 2002年
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苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术及其遗传变异分析

刘云国  
【摘要】: 植物材料在超低温保存过程中,其物质代谢、能量代谢及其它生命活动降至最低限。因而,超低温保存是长期和稳定保存植物种质的有效方法之一。玻璃化超低温保存技术具有操作简单、程序简化及保存效果好等优点,越来越成为超低温保存的主要方法。本试验以离体培养的苹果茎尖作为材料,对玻璃化方法冻存的主要步骤包括继代培养、低温锻炼、预培养、玻璃化冰冻保护剂脱水、冷冻保存、化冻洗涤及再培养进行了优化,筛选了合适的冰冻保护剂PVS3,得到了70%以上的茎尖成活率,并通过对再生苗形态、生化及分子水平的遗传稳定性检测,证明了该方法保存苹果种质资源的可行性。主要实验结果如下: 1.将在高浓度蔗糖溶液(1.5mol.L~(-1))和ABA(0.5mg·L~(-1))的逆境培养基上生长的苹果试管苗继代培养不同时间,分别置于0~7℃的低温下,锻炼0~6周,发现苹果试管苗茎尖(0.5mm)在逆境培养基上继代培养3个月以上,4~5℃低温下锻炼4周以上,经液氮冷冻之后,成活率较高(69%)。 2.对比不同浓度的蔗糖及蔗糖和甘露醇配合使用对成活率的影响发现,单独使用蔗糖时,以0.7 mol.L~(-1)的蔗糖预培养效果较好;而蔗糖配合甘露醇时,0.5 mol.L~(-1)蔗糖加0.2 mol.L~(-1)的甘露醇效果更好。预培养基中去除NH_4~+,添加5%的DMSO,对提高成活率也有一定的效果。在1~4d的预培养时间内,所有预培养基上都以预培养2d成活率最高。 3.分析测定了预培养过程中茎尖含水量和含糖量的变化,结果表明,预培养2d时茎尖含水量和含糖量达到或接近最低和最高值,而冻存之后,其细胞活力最高。 4.设计并研究了5种玻璃化保护剂对成活率的影响,筛选出效果较好的PVS3, (二)刘云国:苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术及其邀传变异分析 其组成为 MS-40%甘油+45%蔗糖-10%乙H醇+10%DMSO (W/V。单独使用 PVS3时 以90min的处理时间最佳。采用分步脱水,即将PVS3稀释2倍和4倍后,分别处理 25min和30min,然后再用PVS3处理80min的效果更好。 5.试验结果表明,茎尖在液氮中的冻存时间不影响成活率。而不同的化冻方法 对细胞活力影响较大,35~40℃的水浴化冻法得到的茎尖细胞活力最高,是较好的化 冻方式。化冻后用 MS+l二 mol.L-‘的蔗糖溶液清洗浸泡 30min。清洗过的茎尖接种 立去掉N*。-的恢复培养基MS+BA 0.6*g.L’+NA* 0.l*g.LJ十0A3 0.5 mg·L’ 上,经过20~30d的生长迟滞期后,进入正常生长,同末经冻存的对照生长量一致。 不同基因型的苹果超低温保存耐受力不一样,在试验的6个品种中,“世界一”的成 活率最高(sl%)。 6.冻存后恢复生长的小苗可以顺利生长、生根,其外部形态与生长发育情况与 对照植株未见差异。比较对照与冻存再生苗叶片及茎的可溶性蛋白SDS-PAGE谱带及 POD同工酶图谱未发现差异,RAPD扩增结果也未见有差异。这说明冻存后再生植株 在形态、生化和分子水平上的遗传稳定性,初步证明了该保存方法应用于苹果种质资 源保存的可行性。
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