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果树GA生物合成基因——贝壳杉烯氧化酶和20-氧化酶的克隆及表达模式的初步研究

石琰景  
【摘要】: 赤霉素在植物生长发育过程中起着非常重要的作用,一是它调节植物茎的生长,二是它还启动LEAFY基因诱导开花,三是它还在促进种子形成和果实发育的过程中起重要作用。而茎的生长,开花的诱导,和果实种子的发育都是果树生产中控制产量和果实品质非常重要的三个环节,因此克隆赤霉素生物合成酶的基因并研究其表达方式及表达调控在果树生产上是非常重要的。 本文克隆了赤霉素生物合成途径中关键合成酶:贝壳杉烯氧化酶和20-氧化酶,并研究了二者在果树生长发育中的表达规律。主要结论如下: 1.利用保守区域的兼并引物克隆了平邑甜茶,丰香草莓和碧桃贝壳杉烯氧化酶基因的长为410bp的中间片段,以中间片段序列为线索又克隆到萆莓贝壳杉烯氧化酶的全长,和碧桃此酶的3’端。丰香草莓贝壳杉烯氧化酶基因全长1650bp,编码区共有539个氨基酸构成。苹果,草莓和桃3种蔷薇科植物的贝壳杉烯氧化酶的序列同源性分别为65%,79%,57%,58%。 2.在丰香草莓的不同发育部位克隆到同源性为88.2%的两个贝壳杉烯氧化酶的基因片段,预示着此基因是个基因家族。基因家族的存在有利于植物进行复杂的调控。 3.对一级结构分析发现4段非常保守的区域,推测是在此酶行使功能时的重要组成部分。分析氨基酸序列的二级结构发现基因N-端具有跨膜的疏水序列,其后具有富含脯氨酸保守区,在距离羧基端60个氨基酸处具有高度保守的血红素结合域。这两处都是P450酶明显的特征结构域。 4.利用半定量RT-PCR的方法结合地高辛标记法,贝壳杉烯氧化酶在果树中的表达是受发育调控的,其在旺盛生长的组织中表达量高,在植株旺长期的成年叶中表达量也很高。在发育过程中,其表达随着旺盛生长而逐渐上升。 5.20-氧化酶负责将生物活性低的GAs转化成生物活性高的GAs。直接用Northern杂交的方法只能在发育中的种子里检测到,本文采用RT-PCR的方法放大表达信号,发现可以在发育中的叶片和茎中检测的到。为我们研究低拷贝基因的表达提供一个值得试用的方法。 6.20-氧化酶在苹果成年叶中表达量很低,说明上游合成的赤霉素中间产物有可能外运作为其它旺盛生长组织的GA合成原料。 7.Southern杂交证明贝壳杉烯氧化酶是多拷贝的。这预示着此酶在植物生长发育过程中起着多种作用,不同的基因可以响应不同的发育信号。


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