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苹果和草莓APETALA2同源基因的克隆以及皇家嘎啦苹果的转化

周盛梅  
【摘要】: AP2/EREBP类转录因子是一类调控植物发育,并且与植物的胁迫耐性有关的转录因子,对AP2/EREBP类转录因子的分类、结构以及功能的研究已经成为分子生物学、生物化学以及生物物理学等研究领域的热点。拟南芥的AP2和ANT基因、玉米的Gl15、IDS1基因、矮牵牛的PhAP2A、PhAP2B基因以及风信子的HAP2基因都属于这一基因家族。但是对于苹果等木本植物的相关研究还鲜有报道。本研究从苹果和草莓栽培品种的花芽中分别分离出AP2的同源基因,并对其表达进行了初步分析。结果如下: (1) 从苹果和草莓的花芽中分别分离出AP2的同源基因,MAP2和SAP2。GenBank登记号分别为AF332215和AF365367。MAP2A全长2212bp,ORF区编码549个氨基酸:SAP2全长1820bp,ORF区编码435个氨基酸。推测氨基酸序列分析表明这两个基因与AP2的氨基酸同源性分别为48.8%和40.0%。MAP2和SAP2内部都含有两个典型的AP2结构域,并且N端都具有高度保守的核定位信号。这些特征说明它们同属于AP2亚族转录因子,在细胞核内表达,可能参与调控花器官、花分生组织发育以及种子和胚乳的形成过程。 (2) 对苹果和草莓的基因组DNA进行的Southern杂交结果显示,MAP2和SAP2基因在基因组内均以低拷贝形式存在。 (3) 鉴于MAP2A基因的表达量较低,我们采用RT-PCR结合Southern杂交的方法,研究了MAP2A基因在苹果不同组织中的表达状况。结果表明MAP2A基因在苹果的叶片和花瓣、萼片、雌蕊、雄蕊等花器官中均有表达。MAP2A基因表达范围广泛的特性与在拟南芥、玉米、矮牵牛和风信子中发现的现象一致。这些基因的功能与其表达部位之间没有明显的相关性。 (4) 我们构建了MAP2-pQE30表达载体,并转入大肠杆菌M15细胞中,经IPTG诱导后,用SDS-PAGE可以检测到MAP2A的表达产物。电泳结果显示,重组菌在40kDa附近明显增加了一条表达量很高、分子量相当于MAP2A蛋白推测大小的条带。说明MAP2A基因可以在大肠杆菌中表达,但是获得的重组蛋白以包涵体形式存在。 2 周盛梅:苹果和草萄二P厂mLA 2同源基因的克隆及皇家嘎啦苹果的转化; 臼)为了验证 ANPZA及其保守区的功能,我们构建了 MAPZA的正义和反 义表达载体,并以“皇家嘎啦,’的叶片为外植体对其进行了农杆菌介 导的遗传转化研究。目前己经获得了2个株系的反义转基因植株和3 个株系的正义转基因植株,转化频率为0.2%。对部分转基因植株进行 的Southern杂交结果显示外源基因已经整合到再生抗性植株的基因组


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