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马铃薯Y病毒衣壳蛋白基因片段长度和结构对RNA介导抗病性的影响

朱俊华  
【摘要】: 马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害,每年均造成严重的经济损失。目前利用抗病毒基因工程培育抗病植株是一条极具潜力的防治植物病毒病害的途径。在植物抗病毒基因工程中,发现一种新的策略为RNA介导的抗病性(RNA-mediated virus resistance,RMVR)。RNA介导的抗病性具有抗病程度高、抗性持久及生物安全性高等优点,但存在抗病谱窄的缺点。目前已证明RNA介导的抗病性是RNA沉默(RNA Silencing)的结果。RNA介导的抗病程度依赖于转基因片段的长度和结构。 本研究是在已证明转化全长马铃薯Y病毒坏死株系衣壳蛋白基因(PVYN-CP)可获得高抗PVY的转基因植株、且证明这种抗性为RNA介导抗病性基础上,进一步研究转基因片段的长度和结构对RNA介导抗病性的影响。即转化马铃薯Y病毒坏死株系衣壳蛋白基因(PVYN-CP)3′端417bp(1/2 CP)和603bp(3/4 CP)的部分基因片段(CP417和CP603), 以寻找高抗PVY转基因植株所需CP基因最短有效长度的cDNA 片段。另外,将马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)部分衣壳蛋白基因设计成反向重复(IR)和正向重复(DR)序列,以研究转基因的结构对RNA介导的抗病性的影响。这一研究结果对改进利用转录后基因沉默策略来防治植物病毒病害以及探讨PTGS产生的机制都具有十分重要的意义,并为今后开展多抗植物病毒遗传育种奠定基础。具体结果如下: 1.马铃薯Y病毒衣壳蛋白基因片段长度对RNA介导抗病性的影响 1.1 根据本实验室已克隆的PVYN全长CP的cDNA序列(804bp),设计了PVYN-CP 3′端部分基因片段(CP417和CP603)的特异引物,以PVYN-CP的cDNA为模板,进行PCR扩增,得到长为417bp(1/2 CP)和603bp(3/4 CP)的部分衣壳蛋白基因扩增产物(CP417和CP603),纯化后用BamHI和KpnI双酶切,与相同酶处理的pBSK连接,热激法转化大肠杆菌,筛选并获得重组克隆质粒pBSK-CP417和pBSK-CP603,对重组克隆质粒进行序列测定,表明我们已成功地克隆出PVYN-CP 3′端417bp和603bp的基因片段。用BamHI和KpnI从重组克隆载体上切下目的基因片段,插入到植物双元表达载体pROKⅡ的BamHI和KpnI位点之间,酶切鉴定表明构建了植物表达载体pROK-CP417和pROK-CP603。 1.2 将构建成功的植物表达载体利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404,PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入农杆菌菌株,可用于烟草转化。 1.3 叶盘法转化烟草NC89。经卡那霉素对再生植株再次抗性筛选、PCR检测,表明转化CP417共获得224株(T0代)转基因植株, 转化CP603共获得77株(T0代)转基因植株。 1.4 转基因植株的抗病性分析表明,以PVYN的病汁液为接种物,汁液摩擦接种转 WP=9 基因烟草。症状观察及ELISA检测表明转基因烟草有三种不同的抗性反应:类型Ⅰ为感病型(Susceptible, S),类型Ⅱ为推迟发病型(Delayed, D),类型Ⅲ为抗病型(Resistant, R)或免疫。其中,在224株转化CP417的转基因烟草中有24株为D型,比例为10.7%;19株为R型,比例为8.48%;在77株转化CP603的转基因烟草中有6株为D 型,比例为7.8%;8株为R型,比例为10.4%。表明转化CP417和CP603均可获得抗病程度达免疫的转基因植株。结合本实验室他人研究结果,表明转化PVYN-CP 3′端202bp不能获得抗病程度达免疫的转基因植株,可知能够诱发RNA介导抗病性所需的PVYN-CP基因的最短有效片段长度位于202bp和417bp之间,对更详细的最短有效片段长度定位有待于进一步研究。 1.5 为了分析转基因的拷贝数与抗病性间的关系,用单一限制性内切酶(HindⅢ)酶切转基因植株的总DNA,分别选取抗病性表现不同(抗病和感病)的部分转基因植株进行Southern blot分析,结果表明转基因的拷贝数与抗病性无明显的相关性。 1.6 转基因植株的Northern blot分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病性与转基因转录本的积累量二者之间呈负相关,即这种抗病性为RNA介导的抗病性,为RNA沉默的结果。 2. 马铃薯Y病毒衣壳蛋白基因片段结构对RNA介导抗病性的影响 2.1 设计了PVYN-CP 5′端252bp和202bp基因片段的特异引物,以PVYN-CP的cDNA为模板,进行PCR扩增,得到长为252bp和202bp的基因扩增产物(CP252,CP202(Ⅰ)和CP202(Ⅱ)),其中CP252和CP202(Ⅰ)(CP202(Ⅱ))5′端的202bp是完全同源或重复,CP202(Ⅰ)和CP202(Ⅱ)的不同之处在于两端酶切位点正好相反。PCR扩增产物用BamHI酶切后,将摩尔数大致相等的两片段加入T4 DNA连接酶于16℃体外连接。其中CP252与CP202(Ⅰ)连接产物具反向重复结构,将其命名为IR(Inverted-repeat)。CP252与CP202(Ⅱ)连接产物具正向重复结构,将其命名为DR(Directed-repeat)。将连接产物从低熔点琼脂糖凝胶中回收后,用XbaI和KpnI双酶切,与用相同酶处理的pBSK连接,热激法转化大肠杆菌。筛选并获得重组质粒pBSK-IR和pBSK-DR。对重组的质粒进行序列测定,表明我们已成功的克隆出PVYN-CP 5′端的IR和DR。用XbaI和KpnI从重组克隆载体上切下目的基因片段,插入到植物双元表达载体pROKⅡ的XbaI和KpnI位点之间,酶切鉴定表明构建了植物表达载体pROK-IR和pROK-DR。 2.2 将构建成功的植物表达载体利用冻融法?


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