小麦紫黄质脱环氧化酶基因的克隆及其表达研究

【摘要】： 植物光合机构中叶绿体色素吸收的光能通过光化学过程转化为稳定的化学能。然而，大多数情况下植物接受的能量要超过其所能转化的能量，如果过量的光能不及时耗散掉，光合功能会降低，导致光合作用的光抑制，甚至出现光氧化、光破坏。依赖于叶黄素循环(Xanthophyll cycle)的热耗散作用近年来受到普遍的关注。它在耗散过剩激发能、保护光合机构中起着主要的作用，被认为是光保护的主要途径。叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时，双环氧的紫黄质(V)在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下，经过中间物单环氧的花药黄质(A)转化为无环氧的玉米黄质(Z)；在暗处，则在玉米黄质环氧化酶(ZE)的作用下朝相反的方向进行，将Z重新环氧化为V，形成一个循环。关于叶黄素循环在防御光抑制和光破坏中的作用已成为光合作用研究的一个热点领域。 本研究欲根据已知植物的紫黄质脱环氧化酶基因序列从小麦叶片中克隆该基因，并利用根癌农杆菌介导法将其反义基因导入烟草中，研究其在烟草植株内的功能表达，为VDE基因工程提供基因资源和理论依据。 RT－PCR法得到小麦紫黄质脱环氧化酶(WVDE)的全系列，cDNA的全长为1,746。其ORF长度为1365bp，编码454个氨基酸，分子量为39.8KD，其中转运肽长度为106个氨基酸，成熟蛋白348氨基酸。GenBank注册号为AF265294。 WVDE cDNA的编码区序列与水稻、拟南芥、烟草、莴苣、菠菜和茶树的同源性分别为78.7%、62.6%、58.3%、60.8%、60.6%和61.2%； 小麦叶片在晴天情况下的PSII最大光化学效率（Fv/Fm）在上午随光强的增加而呈迅速下降，中午12:00达到最低点，表明发生光抑制。与此同时，非光化学猝灭（NPQ）迅速上升，在中午12:00达到最高值，光化学效率变化趋势相反。强光和弱光下叶黄素循环脱环氧化状态存在明显的差异。RT-PCT southern检测结果表明，小麦叶片中的WVDE的表达与反映过剩光能热耗散的NPQ值有很好的线性关系。 选用pBI121载体系统，将WVDE的5'端反向插入到载体中。利用根癌农杆菌介导法转化烟草。经过近60天左右的培养，共获得烟草再生植株80余株。Southern杂交和RT-PCR检测结果，可以断定目的基因已经整合到转基因烟草的基因组中。 WP=9 转基因烟草与对照植株在强光处理的初期和早上照光时间较短、光强较弱时的Fv/Fm和NPQ无较大的差别，但随着照光时间的延长和光强的增加两者的Fv/Fm值的下降和NPQ值的升高开始呈现较大的差异。盐胁迫中转基因烟草与对照的Fv/Fm和NPQ的变化也有相似的结果，胁迫初期两者的Fv/Fm的下降几乎相同，但随着处理时间的增加，转基因株迅速降低，而对照则保持缓慢下降的趋势。4℃低温处理中转基因烟草与对照的Fv/Fm在开始的前3h中下降幅度基本一致，而3h之后转基因株表现出Fv/Fm的急剧降低，但置于弱光下48h后转基因植株的Fv/Fm可以恢复到与对照相同的初始值。研究表明转反义WVDE基因植株抑制了烟草VDE的活性，导致热耗散能力下降。逆境条件下，植物的碳同化过程受到抑制，导致光能更加过剩，在此情况下抑制VDE，光抑制加重。说明WVDE在过剩光能耗散中起重要作用。

【关键词】：小麦 叶黄素循环 紫黄质脱环氧化酶 光保护
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：Q943.2
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