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《山东农业大学》 2003年
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水分胁迫下苹果MAPK基因的克隆、表达特性与信号转导作用

彭立新  
【摘要】: 干旱对植物的影响是多方面的,既有直观的形态学变化,又有生理生化反应,还有基因表达的差异。通常,不同基因型植物在干旱胁迫下的生理生化反应,常作为人们衡量植物耐旱性的依据,在苹果属植物中这方面的研究也较多。然而,有关苹果属植物与耐旱性相关基因的表达调控及其信号转导研究甚少。本研究以3种苹果:湖北海棠(Malus hupehensis(Pamp)Rehd.)干旱敏感型,西府海棠(M.micromalus Makine)中间型,新疆野苹果(M.sieversii(Ldb)Roem)耐旱型为试材,在模拟干旱的条件下首次从西府海棠中克隆了促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)基因的同源基因MaMAPK,并对该基因在3种苹果基因组中的存在状况、表达特性、MAPK激酶活性变化规律及所涉及的信号转导过程进行了初步研究,旨在探讨苹果属植物耐旱的分子机制,为苹果属植物抗旱资源筛选和利用提供依据,主要结果如下: 1.依据高等植物MAPK基因的保守区设计简并引物,用RT-PCR方法,首次从西府海棠幼苗叶片中克隆了促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)基因的cDNA全序列,该基因定名为MaMAPK,在GenBank的注册号为AF435805。同源性分析发现其与苜蓿(Medicago sativa)促分裂原活化蛋白激酶基因(MMK4,X82270)同源性最高,在核苷酸和氨基酸水平上的一致性分别为81%和82%。MaMAPK基因全长1540bp,编码417个氨基酸,具有MAPK基因的11个典型的保守结构域和磷酸化位点“TEY”。Southern杂交结果表明,MoMAPK基因在3种苹果的基因组中均以低拷贝和基因家族形式存在,为进一步研究MaMAP基因的表达调控,揭示苹果属植物耐旱的分子机制奠定了基础。关于逆境胁迫诱导的MAPK基因同源基因的研究在蔷薇科中尚属首次。 2.本研究首次报告了MaMAPK基因的表达调控特性,并从分子水平上证明了苹果属3种植物的耐旱机制。20%PEG处理3种苹果幼苗不同时间后的Northern杂交分析表明,MaMAPK基因在3种苹果根系和叶片(除对照外)中均有表达,随着胁迫时间延长表达量增加,胁迫处理1.5h时表达量最大,随后表达量逐渐减小。液体激酶试验表明,MAPK活性动态变化规律与MaMAPK基因mRNA相对表达量的变化趋势基本一致,不同的是激酶活性高峰迟于mRNA表达高峰,在活性高峰过后激酶活性增幅虽然减小但直至处理结束 彭立新;水分胁迫下苹果MAPK基因的克隆、表达特性与信号转导作用 增幅仍高于对照。Inol儿酪氨酸磷酸酯酶抑制剂PAO对MAPK活性有部分抑制作用, 说明酪氨酸磷酸酯酶的去磷酸化反应对于MAPK的磷酸化具有一定调节作用。if(uslfvuP基 因的表达特性和激酶活性的持续升高及酪氨酸磷酸酯酶抑制剂PAO对ePK活性的部分 抑制作用,说明/lmjlmPK基因不仅在转录水平上受水分胁迫的调控,而且在蛋白质水平 上受磷酸化与去磷酸化的调控。 3种苹果 J(us"vttP基因 mRNA的相对表达量和 MAPK$酶活性均不同,但是激酶活性 动态变化规律与mRNA相对表达量的变化趋势一致,不论是MAPK活性还是mRNA相对表 达量,均以新疆野苹果最高,其次是西府海棠和湖北海棠,说明llsAmPK基因mRNA的相 对表达量和 MAPK激酶活性与 3种苹果抗旱性相关。因此,/lasegmPK基因的 mRNA相对表 达量和 MAPK活性的差异是 3种苹果耐旱性不同的分子机制之一。 3,本研究探讨了苹果属耐旱性不同的3种苹果在水分胁迫下蛋白激酶磷酸化与 ABA合成的关系。结果表明,20%PEG处理3种苹果幼苗不同时间后,3种苹果总蛋白激 酶和 MAPK活性升高的同时,也使ABA积累增加,而且激酶活性高峰均出现在 ABA大量 积累前;用 2 X 10‘mmol几外源 ABA预处理 20。in后,再用PEG加 ABA处理苹果幼苗,我 们发现,苹果根系和叶片中ABA含量均高于仅用ABA处理,说明ABA的合成与水分胁迫 下 MAPK介导的信号转导有直接关系。lP mol/L ePK抑制剂 ITU明显地减少了失水诱导 的ABA的积累,磷酸酯酶抑制剂PAO促进ABA积累,说明MAPK处于磷酸化状态有利于 ABA合成,研究表明在水分胁迫诱导的总蛋白激酶活性中,MAPK活性占76.8%。因此, 水分胁迫下MAPK的磷酸化对于启动ABA合成起主导作用,MAPK介导了水分胁迫下ABA 合成的信号转导过程。 4.本研究阐明了水分胁迫下苹果属植物MAPK的磷酸化与去磷酸化反应与抗氧化酶 类活性的关系。用20%PEG处理苹果幼苗不同时间后,研究表明,水分胁迫一方面诱导 MAPK发生可逆磷酸化反应,MAPK活性提高,同时抗氧化酶类的活性也提高,MAPK活性 高峰出现在抗氧化酶类活性高峰之前。用不同抑制剂加 PEG处理苹果幼苗发现,MAPK 抑制剂ITU不仅抑制了MAPK的活性,也抑制了抗氧化酶类的活性;而磷酸酯酶抑制剂 PAO在部分提高MAPK活性的同时,也提高了抗氧化酶类的活性,证明处于磷酸化状态的 MAPK有利于抗氧化酶类的激活及活性的提高。因此认为,在水分胁迫诱导的信号转导过 程中,MAPK的磷酸化反应激活了抗氧化酶类,并使其活性提高。 5.本研究首次阐明水分胁迫下苹果属植物中MAPK通过可逆磷酸化反应同时介导水 分胁迫。ABA和活性氧的信号转导。研究表明
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