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《山东农业大学》 2003年
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逆转录病毒表达载体的构建及其鸡输卵管生物反应器的制作

王继英  
【摘要】: 由于鸡独特的生殖生理特点,鸡的输卵管生物反应器的研究已成为转基因研究的热点之一。本研究在成功克隆了鸡的卵清蛋白基因5’端调控序列和猪的β干扰素基因的基础上,构建重组逆转录病毒表达载体pLN-OV-INF,利用瞬时感染法,将重组载体pLN-OV-INF及VSV-G膜蛋白的表达载体pVSV共转染GP2293包装细胞以生产复制缺陷性的逆转录病毒,显微注射病毒液于未孵蛋胚下腔中感染鸡胚,采用代用蛋壳法进行体外培养至出壳,制备出含有外源基因序列的转基因鸡,为制作表达猪的β干扰素基因的鸡输卵管生物反应器奠定基础。 提取鸡输卵管组织和猪耳组织基因组DNA,用特异引物PCR扩增出1.1kb的鸡的卵清蛋白基因5’端调控序列和680bp猪的β干扰素基因,连入pMD18-T载体(阳性质粒分别命名为pMD-OV和pMD-INF)后进行测序。测序结果表明猪IFN-β基因与已发表序列完全一致,鸡的卵清蛋白5,调控区虽有五个碱基的突变,但作为调控序列并不影响其应用。 重组逆转录病毒载体构建过程分为两步,首先,用BamHI和MluI酶切质粒pMD-OV和pMD-INF,将猪IFN-β基因片段从质粒pMD-INF上切下及将pMD-OV切成线形质粒,在T4 DNA连接酶作用下将猪IFN-β基因连接在鸡的卵清蛋白基因5’端调控序列的下游,此阳性质粒命名为pMD-OV-INF;其次,用BamHI和SalI酶切质粒pMD-OV-INF,将鸡的卵清蛋白5,调控序列和猪IFN-β基因的连接物切下;再用XhoI和BglⅡ酶切质粒pLNHX ,可获得切除了Phsp70启动子的pLNHX线性质粒,在T4 DNA连接酶的作用下,将鸡的卵清蛋白5,调控序列和猪IFN-β基因的连接物连入切除了Phsp70启动子的pLNHX质粒中,此阳性质粒命名为pLN-OV-INF 。通过酶切和PCR对重组质粒进行鉴定,结果表明所构建的重组逆转录病毒表达载体符合设计要求。 用脂质体转染法将重组载体pLN-OV-INF及VSV-G膜蛋白的表达载体pVSV共转染GP2293包装细胞。因为瞬时转染法生产高滴度的逆转录病毒上清,不依赖于导入质粒的稳定整合,病毒上清液在转染后24-72h内收集。在本实验中采用转染后每隔24h收集一次或只在共转染后48h时收集的病毒收集方式,并对两种收集方式收集的病毒液分别进行病毒滴度测定。病毒滴度测定结果表明:连续收集,病毒滴度先增加后降低,但病毒滴度变化不大均在105左右;若是只在48h时收集一次,病毒滴度比多次收集稍高,说明37℃条件下逆转录病毒半衰期很短,减少病毒收集次数对提高逆转录病毒滴度的作用不大。将病毒上清液浓缩100倍,其病毒滴度可提高约20倍,说明VSV-G蛋白假性化的逆转录病毒可以承受超速离心而仍旧保持感染性。 显微注射病毒液(每个鸡胚5ul)于未孵蛋胚盘的胚下腔中,转入代用蛋壳Ⅰ中石蜡膜封口,放入孵化箱中于38℃、50%的湿度下的自动孵化,三天后转入代用蛋壳Ⅱ中,采用人工翻蛋至孵化第16天停止,从孵化的第18天开始,在封口膜上扎一些小孔以助鸡胚呼吸。本实验共孵出13只雏鸡,10只存活至今。 WP=6 本实验从孵化的第3天开始收集死胚提取基因组DNA,共收集了92只,其中3-5天鸡胚27只取全胚提取DNA,6-9天鸡胚33只分前后两部分取样提取DNA,10-21天鸡胚22只解剖后分别取眼、心、肌肉、脑、性腺等五部分提取DNA。活鸡采取翅下静脉取血及拔取羽毛囊提取DNA。本实验共提取DNA样品223个。 对223个DNA样品进行猪INFβ基因特征带的检测。为提高检测的准确率和降低假阳性率,每次检测均设阳性(模版为猪基因组DNA)和阴性(模板为鸡基因组DNA)对照。在223个DNA样中,PCR检测呈阳性的为54个,平均阳性率为24.2%。其中3-5天、6-9天、10-21天鸡胚分别为81.48%、48.48% 和13.64%,一只活鸡的羽毛囊PCR检测呈阳性,活鸡的阳性率5% 。 本实验一只活鸡的羽毛囊PCR检测呈阳性,说明已获得该鸡部分细胞已整合有外源基因,但性腺细胞是否整合,仍需进一步实验进行验证。实验结果说明利用复制缺陷性逆转录病毒载体法制作鸡的输卵管生物反应器是可行的,需要改进的是进一步提高复制缺陷性的逆转录病毒的滴度和扩大鸡胚的孵化数量以培养出性腺细胞整合有外源基因的转基因鸡。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q789

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【引证文献】
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