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《山东农业大学》 2003年
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渗透胁迫诱导蛋白的分离纯化及信号物质对其表达调控作用的研究

何宝坤  
【摘要】: 本论文以抗逆性强的鲁玉14号玉米品种为材料,采用溶液培养幼苗、渗透胁迫的处理方式,对渗透胁迫下玉米幼苗根系中产生的逆境蛋白进行分离纯化,并研究其生化特性及诱导表达的机理。经过不同渗透胁迫处理的玉米幼苗根系,采用SDS-PAGE凝胶电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析和凝胶过滤层析等技术进行可溶性蛋白质组分分析,发现并分离纯化了一个新的渗透胁迫诱导蛋白,然后对其分子特征和诱导表达机理进行探讨,主要结果如下: 1.胁迫诱导蛋白的发现 将未胁迫处理的材料以及1.0% NaCl和10%PEG胁迫处理的材料,用适当Tris缓冲液提取其全部的可溶性蛋白质,再用SDS-PAGE凝胶电泳进行分析,发现胁迫特异诱导产生几种新蛋白质,其中一种分子量为26.8KD,非常类似于已经报道的盐适应烟草细胞产生的渗调蛋白(Osmotin)。该蛋白可能为一种盐适应蛋白,在玉米幼苗抗盐胁迫的过程中起着非常重要的作用。由于该蛋白存在于玉米幼苗根系中,以后简称ZmR26.8(26.8KD protein in Zea Mays root)蛋白。 2.纯化材料处理条件的确定 为了分离纯化出ZmR26.8蛋白,要求材料方便廉价,并尽量含有较多目标蛋白。用不同浓度NaCl、PEG处理玉米幼苗根系不同时间,进行电泳分析,发现先用1.0%NaCl处理72h,再用1.5%NaCl处理72h后,ZmR26.8蛋白的含量要高于一直用1.0% NaCl处理144h;也高于先用10%PEG处理72h,再用15%PEG处理72h的渐进胁迫,而且用NaCl处理的成本要低于PEG处理。所以,综合考虑纯化材料的最佳处理方法为先用1.0%NaCl处理72h,再用1.5%NaCl处理72h的渐进胁迫。 WP=7 3.样品的制备 将处理好的材料用液氮研磨,加入适宜Tris提取液(100mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,1mmol/L PMSF,2%β-巯基乙醇,pH7.5),放在4℃下提取20分钟左右,然后4℃下5000 ╳g离心20分钟,去除沉淀取上清液。进行硫酸铵分级沉淀,适合的硫酸铵浓度为60%~90%。硫酸铵沉淀后,4℃下10 000 ╳g离心30分钟,取沉淀用层析缓冲液(50mmol/L乙酸,5mmol/L EDTA,1mmol/L PMSF,2%β-巯基乙醇,pH4.0)再溶解,用相同的缓冲液透析36h,期间更换3次缓冲液,使其体积大约为50ml左右。 4.层析分离 将以上蛋白质溶液过层析柱,先过CM-Sepharose Fast Flow 阳离子交换柱,并用0~0.5M NaCl进行洗脱,分别收集不同峰洗脱液,进行检测。将含有ZmR26.8蛋白洗脱液收集在一起,透析后浓缩至体积为2~3ml准备过分子筛,凝胶为SephacrylS-100 HR,分别收集不同蛋白质峰的流出液,检测各峰的蛋白质,即可得到电泳纯的ZmR26.8蛋白溶液。 5.特性分析 将分离纯化后的ZmR26.8蛋白进行特性分析,通过SDS-PAGE电泳、等电聚焦和热稳定性实验,对该蛋白的分子量、等电点和热稳定性进行测定,该蛋白的分子量、等电点分别为26.8KD和6.5,并为热稳定蛋白。 6. ZmR26.8蛋白诱导表达机理 在胁迫处理的同时,并添加ABA、ABA抑制剂、磷脂酶D(PLD)、磷脂酶C(PLC)的抑制剂新霉素硫酸盐、正丁醇以及Ca2+抑制剂EGTA、钙调蛋白(CaM)抑制剂盐酸三氟拉嗪(TFP)等抑制剂;以及外源施加水杨酸(SA)、KCl和K+通道抑制剂。用SDS-PAGE凝胶电泳检测ZmR26.8蛋白表达量的变化情况,结果表明,信号物质ABA、PLD/PLC、Ca2+/CaM等对盐胁迫诱导ZmR26.8KD蛋白的表达有一定的影响,参与盐胁迫信号的传递;SA和K+对ZmR26.8KD蛋白的表达可能没有影响。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S513

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【引证文献】
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