渗透胁迫诱导蛋白的分离纯化及信号物质对其表达调控作用的研究

【摘要】： 本论文以抗逆性强的鲁玉14号玉米品种为材料，采用溶液培养幼苗、渗透胁迫的处理方式，对渗透胁迫下玉米幼苗根系中产生的逆境蛋白进行分离纯化，并研究其生化特性及诱导表达的机理。经过不同渗透胁迫处理的玉米幼苗根系，采用SDS-PAGE凝胶电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析和凝胶过滤层析等技术进行可溶性蛋白质组分分析，发现并分离纯化了一个新的渗透胁迫诱导蛋白，然后对其分子特征和诱导表达机理进行探讨，主要结果如下： 1.胁迫诱导蛋白的发现 将未胁迫处理的材料以及1.0％ NaCl和10％PEG胁迫处理的材料，用适当Tris缓冲液提取其全部的可溶性蛋白质，再用SDS-PAGE凝胶电泳进行分析，发现胁迫特异诱导产生几种新蛋白质，其中一种分子量为26.8KD，非常类似于已经报道的盐适应烟草细胞产生的渗调蛋白（Osmotin）。该蛋白可能为一种盐适应蛋白，在玉米幼苗抗盐胁迫的过程中起着非常重要的作用。由于该蛋白存在于玉米幼苗根系中，以后简称ZmR26.8(26.8KD protein in Zea Mays root)蛋白。 2.纯化材料处理条件的确定 为了分离纯化出ZmR26.8蛋白，要求材料方便廉价，并尽量含有较多目标蛋白。用不同浓度NaCl、PEG处理玉米幼苗根系不同时间，进行电泳分析，发现先用1.0％NaCl处理72h，再用1.5％NaCl处理72h后，ZmR26.8蛋白的含量要高于一直用1.0％ NaCl处理144h；也高于先用10％PEG处理72h，再用15％PEG处理72h的渐进胁迫，而且用NaCl处理的成本要低于PEG处理。所以，综合考虑纯化材料的最佳处理方法为先用1.0％NaCl处理72h，再用1.5％NaCl处理72h的渐进胁迫。 WP=7 3.样品的制备 将处理好的材料用液氮研磨，加入适宜Tris提取液(100mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF，2％β-巯基乙醇，pH7.5)，放在4℃下提取20分钟左右，然后4℃下5000 ╳g离心20分钟，去除沉淀取上清液。进行硫酸铵分级沉淀，适合的硫酸铵浓度为60％～90％。硫酸铵沉淀后，4℃下10 000 ╳g离心30分钟，取沉淀用层析缓冲液(50mmol/L乙酸，5mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF，2％β-巯基乙醇，pH4.0)再溶解，用相同的缓冲液透析36h，期间更换3次缓冲液，使其体积大约为50ml左右。 4.层析分离 将以上蛋白质溶液过层析柱，先过CM-Sepharose Fast Flow 阳离子交换柱，并用0～0.5M NaCl进行洗脱，分别收集不同峰洗脱液，进行检测。将含有ZmR26.8蛋白洗脱液收集在一起，透析后浓缩至体积为2～3ml准备过分子筛，凝胶为SephacrylS-100 HR，分别收集不同蛋白质峰的流出液，检测各峰的蛋白质，即可得到电泳纯的ZmR26.8蛋白溶液。 5.特性分析 将分离纯化后的ZmR26.8蛋白进行特性分析，通过SDS-PAGE电泳、等电聚焦和热稳定性实验，对该蛋白的分子量、等电点和热稳定性进行测定，该蛋白的分子量、等电点分别为26.8KD和6.5，并为热稳定蛋白。 6. ZmR26.8蛋白诱导表达机理 在胁迫处理的同时，并添加ABA、ABA抑制剂、磷脂酶D（PLD）、磷脂酶C（PLC）的抑制剂新霉素硫酸盐、正丁醇以及Ca2＋抑制剂EGTA、钙调蛋白（CaM）抑制剂盐酸三氟拉嗪（TFP）等抑制剂；以及外源施加水杨酸(SA)、KCl和K＋通道抑制剂。用SDS-PAGE凝胶电泳检测ZmR26.8蛋白表达量的变化情况，结果表明，信号物质ABA、PLD/PLC、Ca2＋/CaM等对盐胁迫诱导ZmR26.8KD蛋白的表达有一定的影响，参与盐胁迫信号的传递；SA和K＋对ZmR26.8KD蛋白的表达可能没有影响。

【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：S513