收藏本站
《山东农业大学》 2004年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

利用RNA介导的病毒抗性培育双抗病毒转基因植株

白庆荣  
【摘要】:植物病毒病害是农作物生产中的重要病害,给农业生产造成巨大的损失。马铃薯 Y 病毒(PVY)对马铃薯、烟草等重要经济作物危害十分严重,其侵染所造成的损失可达 80%,尤其是马铃薯 Y 病毒坏死株系(PVYN)可以造成寄主提前死亡而绝收。马铃薯 X 病毒(PVX)单独侵染可使马铃薯产量损失 10%~20%,但是 PVX 在田间常常与其它病 毒混合侵染,特别是马铃薯 Y 病毒与之混合侵染引起的病毒协生作用,在生产中造成的 损失更为严重。RNA 介导的病毒抗性(RNA-Mediated Virus Resistance, RMVR)是近年 来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略,具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久、 生物安全性高等优点,但也存在抗病谱窄的缺点。本实验室转化非翻译马铃薯 Y 病毒坏 死株系的衣壳蛋白基因(PVYN-MCP)或者该基因不同长度的基因片段,均获得高度抗病 的转基因植株,且证明这种抗病性为 RNA 介导的抗病性。此外,本实验室将马铃薯 Y 病毒坏死株系的部分衣壳蛋白基因 3′ 端和 5′ 端 200bp 的基因片段设计成反向重复(IR) 和正向重复(DR)序列,都获得不同比例的抗病转基因植株,但反向重复转基因获得 抗性转基因植株比例高于转正向重复的转基因植株。 基于生产中存在的问题和本实验室的研究基础,本研究将非翻译马铃薯 X 病毒的衣 壳蛋白基因(PVX-CP)和非翻译马铃薯 Y 病毒的衣壳蛋白基因(PVYN-CP)不同长度 以不同顺序组成嵌合基因,构建植物表达载体;另外用 PVX-CP 和 PVYN-CP 的 3′ 端 200bp 的基因片段以不同的连接顺序构建了基于 pFGC5941(dsRNA 植物表达载体)和 pROKII 设计的 Hairpin 结构植物表达载体,转化烟草,以探索利用这一策略培育多抗病 毒转基因植株的可行性,并寻找赋予 RNA 介导抗性的最短有效片段的长度,从而为今 后进行植物多抗病毒育种奠定基础。研究结果和主要结论如下: 1.非翻译 PVYN-CP 和 PVX-CP 以不同长度和顺序组成嵌合基因转化烟草的抗病性研究 1.1根据本实验室已克隆的PVYN-CP的全长cDNA序列(804bp)和PVX-CP的全长cDNA 序列设计了非翻译全长及 3′ 端部分基因片段的特异引物,以 PVX-CP 和 PVYN-CP 的 cDNA 为模板,进行 PCR 扩增,得到相应的基因扩增产物,PCR 产物纯化后进行单酶 切,用 T4 DNA 连接酶把相应的基因片段进行体外连接,双酶切纯化后,与用相同酶处 理的克隆载体 pUC19 连接,热激法转化大肠杆菌 DH5α,筛选并获得重组克隆质粒 pUCXY、pUCfXY、pUCYX 和 pUCfYX。序列测定表明,已成功克隆出嵌合基因 XY、 1 WP=14 利用 RNA 介导的病毒抗性培育双抗病毒转基因植株 fXY、YX 和 fYX。构建植物表达载体 pROKXY、pROKYX、pROKfXY 和 pROKfYX。 1.2 将成功构建的植物表达载体利用冻融法直接导入农杆菌 LBA4404。叶盘法转化烟草 NC89。再生植株经卡那霉素抗性筛选和 PCR 检测,结果表明,转化 pROKXY、pROKYX、 pROKfXY 和 pROKfYX 分别获得 338、275、454、589 株 T0 代转基因植株。 1.3 转基因植株的抗病性分析表明,只有转化 pROKXY 的转基因植株中出现 6 株对两种 病毒的抗性都达到免疫的植株。转 pROKYX、pROKfXY 和 pROKfYX 的 T0代转基因植 株中没有抗病表现型出现。 1.4 为了分析转基因的拷贝数与抗病性的关系,对转化 pROKXY 获得的抗病转基因植株 和部分感病转基因植株进行 Southern blot 分析,结果表明,抗病植株的转基因多数为多 拷贝(5~6 个拷贝),而感病植株的转基因拷贝数明显偏低(1~3 个拷贝)。 1.5 转基因植株的 Northern blot 分析表明,转基因都在 RNA 水平上得到了表达,不同抗 病表现型的转基因植株之间在 RNA 积累量上存在差异,抗病植株的 RNA 积累量明显少 于感病植株。这说明抗病性为 RNA 介导的抗病性,是 RNA 沉默的结果。 2. PVYN-CP 3′ 端基因片段和 PVX-CP 3′ 端基因片段组成嵌合基因构建 Hairpin 结构基 因转化烟草的抗病性研究 2.1 带有内含子的 Hairpin 结构植物表达载体的构建 根据本实验室已克隆的 PVYN-CP 的全长 cDNA 序列(804bp)和 PVX-CP 的全长 cDNA 序列以及双链植物表达载体 pFGC5941 引物设计要求,设计了两种病毒 CP 基因 3′ 端 200bp 基因片段的特异引物,以 PVX-CP 和 PVYN-CP 的 cDNA 为模板,进行 PCR 扩 增,得到 200bp 的基因扩增产物。将扩增产物单酶切后,按照预先设计的连接方式 用 T4 DNA 连接酶于 16℃体外连接。从低熔点琼脂糖凝胶电泳中回收连接产物 X200Y200 和 Y200X200,用相应的酶(BamHI 和 XbaI)进行双酶切,再与用相同酶处理的克隆载体 pUC19 连接,热激法转化大肠杆菌 DH5α。筛选并获得重组克隆质粒 pUCX200Y200 和 pUCY200X200。对重组质粒进行序列测定,表明我们已经成功克隆出嵌合基因 X200Y200 和Y200X200。先用NcoI和SwaI从重组质粒上切下嵌合基因,与用相同酶处理的pFGC5941 进行连接,构建中间植物表达质粒 pFXY 和 pFYX,再用 XbaI 和 BamHI 从重组质粒上 切下嵌合基因,与用相同酶处理的中间植物表达质粒 pFXY 和 pFYX 连接,热激法转化 大肠杆菌 DH5α。重组质粒用 NcoI 进行酶切鉴定,鉴定结果表明植物表达载体 pFXYiYX 和 pFYXiXY 构建成功。 2.2 Hairpin 结?
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S332

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 温孚江,朱常香;转录后基因沉默与植物的病毒抗性[J];生物工程学报;2001年03期
2 纪宗玲,刘继中,陈苏民;基因功能的研究方法[J];生物工程学报;2002年01期
3 刘杨,蒋彦,乔代蓉,曹毅;转录后基因沉默的机制及其应用[J];生物工程学报;2002年02期
4 李艳,李毅,陈章良;转基因植物内源基因与外源基因共抑制问题研究进展[J];生物工程学报;1999年01期
5 周晓馥,王兴智;病毒诱导基因沉默——植物抗病的可能机制[J];松辽学刊(自然科学版);2001年03期
6 孟祥兵,贾寿华,王秀芳;基因沉默与生长发育[J];生命的化学;2002年02期
7 周雪平,李德葆;抗病毒基因工程与转基因植物释放的环境风险评估[J];生命科学;2000年01期
8 袁婺洲,吴秀山;RNAi机制研究的最新进展[J];生命科学研究;2003年01期
9 牛颜冰,青玲,周雪平;RNA沉默机制及其抗病毒应用[J];中国生物工程杂志;2004年02期
10 赫然,刘秋云;RNA干涉与功能基因组[J];生物技术通讯;2002年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王传堂,赵双宜,苗华荣,李正超,徐建芝;通过花萼管注射法获得转基因花生研究初报 I.部分后代叶片Gus活性分析[J];花生科技;1999年S1期
2 王芳,张斌,单雷,毕玉平,许泽永;一种从花生种子中提取RNA的改进方法[J];花生学报;2002年04期
3 李庆云,庄东红,胡忠,黄秀丽;花生不同部位对提取DNA的影响[J];花生学报;2003年02期
4 邹湘辉,庄东红,郑奕雄,侯建,关秀琼;花生不同品种外植体培养芽诱导的研究[J];花生学报;2003年S1期
5 詹洁;余永昌;何龙飞;伍荣冬;;一种优化的提取花生根尖细胞DNA的方法[J];花生学报;2006年03期
6 杨永智;王舰;张艳萍;周云;孙海宏;;植物外源基因转移技术综述[J];青海农林科技;2007年01期
7 段瑞君;RNA干涉方法在拟南芥钙调蛋白类基因研究中的应用[J];青海大学学报(自然科学版);2005年02期
8 黄春琼;郭安平;孔华;贺立卡;;基因工程在花卉育种中的应用进展[J];热带农业科学;2006年02期
9 陈春宝;黎小瑛;周鹏;;番木瓜抗病育种及其组培苗生产概述[J];热带农业科学;2006年06期
10 胡军瑜;王俊刚;蔡文伟;张树珍;李晓君;;甘蔗基因组RNA提取方法的研究[J];热带农业科学;2009年06期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘俊君,彭学贤,莽克强;番木瓜环斑病毒复制酶(亚基)基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建[J];生物工程学报;1994年03期
2 邵莉,李毅,潘爱华,陈章良,陈敏;查尔酮合酶基因的克隆、全序列分析及在大肠杆菌中的高效表达[J];生物工程学报;1995年02期
3 项瑜,杨兰英,彭学贤,莽克强;改造的马铃薯Y病毒复制酶基因介导高度抗病性[J];生物工程学报;1996年03期
4 温孚江,朱常香;转录后基因沉默与植物的病毒抗性[J];生物工程学报;2001年03期
5 周雪平,李德葆;抗病毒基因工程与转基因植物释放的环境风险评估[J];生命科学;2000年01期
6 郭兴启,温孚江,朱常香;转基因植物中RNA介导的病毒抗性研究进展[J];生命科学;2000年04期
7 彭学贤,项瑜,刘俊君,莽克强;马铃薯Y病毒复制酶基因的克隆和序列分析[J];生物多样性;1994年01期
8 袁婺洲,Bodmer R,朱传炳,王跃群,李永清,吴秀山;利用RNAi技术研究果蝇心脏发育基因的功能[J];遗传学报;2002年01期
9 汤富酬,薛友纺;RNA干涉与基因沉默[J];遗传;2001年02期
10 韩蓓,王秀敏,顾学范;双链RNA干涉技术(RNAi)在不同生物中应用的研究进展[J];遗传;2002年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 赵福宽,张鹤龄,哈斯阿古拉,刘纪麟,郑用琏;马铃薯转CP基因育种研究进展[J];北方园艺;1999年04期
2 赵福宽,张鹤龄,郑用琏,刘纪麟;分子生物技术在马铃薯抗病毒育种中的应用[J];世界农业;1998年11期
3 ;马铃薯秋播全苗增产措施[J];农业科技通讯;1978年05期
4 陈永贤;马铃薯丰产栽培技术[J];新疆农业科学;1979年01期
5 王法典;;中国马铃薯专业委员会在哈成立[J];蔬菜;1986年06期
6 А.А.Багчев ,王惠萍 ,岳先毅;СН-4Б型马铃薯种植机的改进[J];粮油加工与食品机械;1988年06期
7 陈伊里;王永智;滕宗璠;;黑龙江省马铃薯种植区划的研究[J];中国马铃薯;1988年02期
8 陆恒;;贮藏中的马铃薯怎样管理[J];农业工程技术.温室园艺;1991年06期
9 阎万祥;;马铃薯选种工作中应注意的两个问题[J];种子世界;1991年11期
10 胡百森;;江西南部蔗田冬季套种马铃薯技术调查[J];中国马铃薯;1993年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王萍;;转基因马铃著作为生物反应器的研究[A];2007年中国马铃薯大会(中国马铃薯专业委员会年会暨学术研讨会)、全国马铃薯免耕栽培现场观摩暨产业发展研讨会论文集[C];2007年
2 李晶;卢翠华;陈伊里;;马铃薯抗晚疫病基因工程研究进展[A];中国作物学会马铃薯专业委员会2002年年会论文集[C];2002年
3 卢翠华;邸宏;李文滨;丛培琳;姜丽丽;;农杆菌介导的CryV、CBF1基因对马铃薯的遗传转化[A];全国“植物生物技术及其产业化”研讨会论文摘要集[C];2007年
4 高占旺;高永龙;宋伯符;;马铃薯抗病毒种子后代在河北坝上的评价[A];中国马铃薯学术研讨文集(1996)[C];1996年
5 张柏顺;徐梅梅;杨煜;郭晓;李广存;;马铃薯RIN4-like基因全长cDNA的克隆与基因转化[A];第六届中国植物逆境生理学与分子生物学学术研讨会论文摘要汇编[C];2010年
6 王萍;王罡;季静;;马铃薯不同外植体的组织培养[A];2006年中国作物学会马铃薯专业委员会年会暨学术研讨会论文集[C];2006年
7 解玉琴;郭雄;;互助县控制马铃薯病害发生的几项技术措施[A];马铃薯产业与粮食安全(2009)[C];2009年
8 赵国琦;魏冬梅;贾海兵;;马铃薯脱毒小薯(Minituber)栽培试验研究[A];中国马铃薯学术研讨文集(1996)[C];1996年
9 赵江雷;;沈阳地区春季大棚马铃薯栽培技术[A];中国作物学会马铃薯专业委员会2008年马铃薯大会论文集[C];2008年
10 蔡兴奎;柳俊;谢从华;;细胞工程育种在马铃薯抗病育种中的应用[A];全国作物细胞工程与分子技术育种学术研讨会论文集[C];2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王新萍;2008年:“国际马铃薯年”[N];中国社会报;2008年
2 记者 庄俊康通讯员 闫涛;土豆良种补贴增至500万[N];甘肃经济日报;2008年
3 张倩;农民代表的“马铃薯建议”[N];甘肃日报;2008年
4 记者 卜彦兵通讯员 牛建军;定西马铃薯文化书画笔会在通渭举行[N];定西日报;2008年
5 奇暄;马铃薯深加工为勃利农民辟富路[N];黑龙江经济报;2008年
6 记者 吴俊;农业部等多部门助宁夏销售马铃薯[N];中国食品质量报;2008年
7 通讯员汪姝琴、刘海洲;嘉鱼抓好马铃薯技术培训[N];咸宁日报;2008年
8 山东天泰种业 孙田;天泰三号马铃薯及配套高产栽培措施[N];山东科技报;2008年
9 王雨 王千钧 王纲;舞起龙头富一方[N];甘肃日报;2009年
10 记者德力格尔 通讯员贺峥;察右后旗21.52万亩设施马铃薯增收7100万元[N];内蒙古日报(汉);2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 白庆荣;利用RNA介导的病毒抗性培育双抗病毒转基因植株[D];山东农业大学;2004年
2 徐丽;马铃薯Y病毒复制酶基因介导的病毒抗性研究[D];山东农业大学;2010年
3 秦爱国;马铃薯脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆和功能分析[D];山东农业大学;2009年
4 张余洋;转基因番茄标记基因剔除及翻译起始因子4E基因顺化植物的病毒抗性[D];华中农业大学;2006年
5 吴斌;马铃薯Y病毒及水稻黑条矮缩病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性影响[D];山东农业大学;2012年
6 赵燕;马铃薯(Solanum tuberosum L.)花粉特异表达基因ST901的克隆及其功能研究[D];中国农业大学;2004年
7 张宁;应用甜菜碱醛脱氢酶基因工程提高马铃薯抗逆性的研究[D];甘肃农业大学;2004年
8 贾芝琪;晚疫病抗性信号传导研究体系的构建和番茄抗病资源的创新[D];中国农业科学院;2008年
9 张俊莲;利用拟南芥液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)改良马铃薯耐盐性的研究[D];甘肃农业大学;2006年
10 杨培龙;来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶在植物中的高效表达[D];中国农业科学院;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈亚兰;马铃薯反义PPO基因遗传转化体系的优化及转基因植株PPO活性、同工酶的分析[D];甘肃农业大学;2005年
2 万鹏;农杆菌介导IP-10基因遗传转化马铃薯的研究[D];东北林业大学;2008年
3 张丽青;新城疫病毒河北分离株F基因的克隆、植物表达载体构建及转化马铃薯的研究[D];河北农业大学;2008年
4 刘建荣;农杆菌介导的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因转化马铃薯的方法研究[D];甘肃农业大学;2000年
5 郝文胜;切割PLRV复制酶基因负链的核酶基因对马铃薯转化及检测[D];内蒙古农业大学;2001年
6 李娟;马铃薯(Solanum tuberosum L.)愈伤组织培养和耐盐突变体的离体筛选[D];西北农林科技大学;2003年
7 封莉;马铃薯挖掘机筛分系统的性能研究[D];河北农业大学;2004年
8 李韵涛;马铃薯薯条及其余料加工工艺的研究[D];中国农业大学;2005年
9 张峰;马铃薯花粉原生质体的分离与培养[D];甘肃农业大学;2001年
10 孟千万;根瘤农杆菌介导的GNA基因转化马铃薯研究[D];西南农业大学;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026