大白菜营养品质性状遗传效应分析及TuMV-Nib基因克隆与转化研究

【摘要】：大白菜(Brassica campestris subspecies.pekinensis (Lour) Olsson)属芸薹属植物,是原产中国、栽培面积最大的重要蔬菜之一。随着人们生活水平的提高,对大白菜的周年供应和品质风味等有了更高的要求。营养品质性状多为数量性状,在其遗传研究方面,有关主要品质性状的遗传效应研究,特别是在矿质元素含量的遗传效应、各性状间的遗传相关性上研究和报道尚少。在大白菜育种上,采用常规育种方法实现优质与抗病性状的结合面临很多困难。因此,利用基因工程技术对传统优质大白菜品种进行抗病性改良,具有重要的经济价值和现实意义。我们在克隆了TuMV-Nib基因、构建无选择标记基因的通用表达载体的基础上,构建了其反义植物表达载体,利用农杆菌介导等方法将TuMV-Nib反义基因导入大白菜敏感品系(福山包头、石特)中,并获得了抗病毒工程植株。利用基因工程手段创新大白菜种质,实现抗病性与优质的结合,从而为提高大白菜的育种水平奠定了基础。具体研究结果如下: 1.选用大白菜3个生态型的6个高代自交系进行完全双列杂交,对其干物质、Vc、可溶性糖、有机酸、粗纤维和氨基酸含量进行遗传效应分析的研究结果表明,Vc、有机酸、干物质及粗纤维含量符合加性-显性-母体效应(ADM)遗传模型,其狭义遗传率分别为53.1%、13.5%、38.3%和28.2%;可溶性糖及氨基酸含量符合加性-显性(AD)遗传模型,狭义遗传率分别为18.4%和40.3%。可溶性糖与干物质含量呈显著正相关,相关系数为0.746;Vc与干物质含量呈显著正相关,相关系数为0.293,与有机酸、粗纤维含量呈显著负相关,相关系数分别为0.305和0.366。 2.研究了大白菜产量和营养品质性状的杂种优势和遗传效应。结果表明,除可溶性糖含量杂种优势表现不明显外,其它多数性状都不同程度地表现出群体平均优势。其中,直筒×叠抱类型的单株产量、Vc正向优势明显。Vc、可溶性糖、可溶性蛋白质与干物质含量呈显着正相关,有机酸则与之相反,表明通过选择干物质含量高的亲本,可以间接实现优质育种的有关目标。 3.研究大白菜主要矿质营养元素含量的遗传效应。结果表明,K、Ca、Fe、Mn含量符合加性-显性-母体效应-(ADM)遗传模型,其狭义遗传率分别为14.05%、25.2%、3.02%、15.18%;Na、P、Mg和Zn含量符合加性-显性(AD)遗传模型,其狭义遗传率分别为30.45%、37.73%、2.55%和16.6%。 4.对不同生态型大白菜风味物质的测定结果表明,在风味物质的种类和含量上均 WP=12 有差别。这是决定各自生态型特有风味的原因所在。苯丙烷腈、邻苯二甲酸酐、异硫氰酸苯乙酯、2-烯丙基硫代-1-硝基丁烷杂种优势较强。 5.在对大白菜三个结球类型的不同品种(自交系)、不同外植体及培养基附加成分等的研究结果表明,大白菜不同基因型间不定芽分化率有明显差异,供试材料中以叠抱类型的“秋白19号”和合抱类型的“福山包头”再生率较高,直筒类型大白菜不定芽分化率低;带柄子叶是离体培养较理想的外植体。分化培养的最佳培养基为MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+4mg/L AgNO3+0.3mg/L ABA,蔗糖3.0%,琼脂1.0%。本试验建立了大白菜带柄子叶的高频再生系统,从接种到获得再生植株只需55-60d,已基本满足遗传转化对受体再生系统的要求。 6.本实验对影响大白菜转化效果的因素进行了优化。以LBA4404(含TuMV-Nib基因)为供试菌株,以“福山包头”、“石特”等大白菜的带柄子叶为转化受体,初步建立了高效的白菜类作物遗传转化体系。在农杆菌介导的大白菜遗传转化中确定适宜筛选压力为卡那霉素10mg/L,羧苄青霉素500mg/L为较理想的农杆菌抑制剂。建立的大白菜遗传转化体系如下:在无菌条件下,切取苗龄5~6d的大白菜无菌幼苗的带柄子叶,插入预培养基中,在与分化培养相同条件下预培养2d。将其在含农杆菌(LBA4404含pBTuMV–Nib基因)的MS0悬浮液中浸染5~10min,用无菌滤纸吸干水分后转入共培养基中,共培养2d。共培养后的子叶柄外植体用附加羧苄青霉素500mg/L的无菌水漂洗3~4次、附加羧苄青霉素500mg/L的MS0培养液漂洗1次,再用无菌滤纸吸干水份,转入选择培养基上筛选抗性芽;每15d更换一次选择培养基。当外植体在选择培养基上选择35~40d后,切取绿色不定芽,转入生根培养基中生根,大约30d可发育成完整的小植株。本实验获得转化株系17株。其中:福山包头转化株11株,转化芽成功率为7.3%;石特转化株6株,转化芽成功率为3.0%。 7.本实验试图利用真空渗入技术对大白菜受体进行转化,探讨其可行性,以便为大白菜这种难以再生的物种拓宽转化途径。试验结果表明,利用真空渗入技术转化大白菜福山包头、石特79-3,转化率皆在万分之一左右。 8.本实验重点进行了芜菁花叶病毒复制酶基因(TuMV-Nib)片段的克隆及其反义表达载体的构建,构建了不含筛选标记基因的双子叶植物通用表达载体,并对上述基因进行了转化实验。根据TuMV-C4复制酶基因序列设计引物,从感病大白菜叶片的总RNA中,利用RT-PCR技术扩增出TuMV-Nib基因片段,克隆到pMD18-T载体中,经测序发现与已知TuMV多个株系复制酶序列有很高的同源性。用BamH I/Pst I从重组质粒中 WP=13 切出TuMV-Nib片段,反向插入到pROK2、pROK的启动子之后,转化农杆菌LBA4404,获得了工程菌株。43株转基因植株经PCR特异性扩增为阳性,Southern杂交结