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《山东农业大学》 2004年
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我国近年来马立克氏病病毒野毒株分子流行病学和生物学特性的研究

张志  
【摘要】:为了研究我国近年来鸡群中马立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)流行毒株 的致病性变异状况及其分子衍化规律,本文采用细胞培养、间接荧光抗体试验、病理组 织学检查、斑点杂交和 PCR 扩增的方法从我国各地不同省份的鸡场采集样品进行马立 克氏病病毒(MDV)的分离和鉴定。从 63 只疑似肿瘤鸡采集的全血接种鸡胚成纤维细 胞(CEF)后分离到 19 株 MDV 野毒株。这 19 株 MDV 野毒株的细胞培养中,有 7 株 MDV 感染的细胞不与禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)的 单抗 11B154 和 11B118 反应,用聚合酶链式反应(PCR)也扩增不出 REV 的长末端重 复序列(LTR);另有 7 株 MDV 感染的细胞既能与 REV 的单抗反应,又可以用 PCR 扩 增出 REV 的 LTR,表明这 7 株 MDV 感染的细胞中含有完整的 REV 游离病毒;另有 5 株 MDV 感染的细胞与 REV 核酸标记的探针呈现阳性反应,也能扩增出 REV 的 LTR, 但却不与 REV 的单抗反应,表明这 5 株 MDV 的基因组中可能已整合了 REV 的基因组 成分;这些结果表明我国 MDV 野毒株中 REV 的共感染现象十分普遍,并且很可能部 分 MDV 毒株的基因组中已经整合了 REV 的基因组成分。 为了研究 MDV 和 REV 在对鸡的致肿瘤过程中的相互作用,本文用 REV 和 MDV 共感染 1 日龄雏鸡,结果表明,雏鸡共感染 MDV 和 REV 后 24 天即可发生死亡,到 94 日龄时死亡率已达 63.3%;而单独感染 MDV 和 REV 后的死亡日龄分别出现在感染后 47 日龄和 45 日龄,且 94 日龄时的死亡率分别为 33.3%和 36.7%。共感染 REV 和 MDV 鸡的体重在 21 日龄、38 日龄和 76 日龄时的体重分别为 153、397、920 克;而单独感染 MDV 或 REV 同日龄鸡的体重分别为 200、494、1197 和 173、410、1107 克,表明共感 染 REV 和 MDV 后对鸡生长性能的不良影响较单独感染 MDV 或 REV 时更为明显。共 感染 MDV 和 REV 死亡鸡的肝脏、脾脏、肾脏和心脏等可以形成两种外观明显不同的 散在的大肿瘤结节和弥漫性的小肿瘤结节。取发病鸡的肝脏、脾脏、肾脏、心脏和腺胃 等组织样品用石蜡包埋后进行连续切片,HE 染色后发现这些脏器均存在两种不同类型 的肿瘤细胞增生。对这些连续切片分别用 MDV 和 REV 的单克隆抗体进行间接荧光试 验,在同一份样品同时存在可以与 REV 和 MDV 分别呈现阳性反应的肿瘤细胞团,这 说明 REV 和 MDV 可以在感染鸡的体内分别诱发形成肿瘤。在接种后 76 日龄随机采集 3 只鸡的全血分离白细胞进行血液中 MDV 含量的检测,结果表明 MDV 单独感染引起 3 WP=9 山东农业大学博士学位论文 的平均阳性率为 3.4%,而共感染 REV 以后的阳性率仅为 7.67%。 将 REV 和 MDV 共感染 CEF 或将 MDV 单独感染的 CEF 比较 REV 对 MDV 体外增 殖的影响,连续 4 代以后,单独感染 MDV 的病毒含量为共感染 REV 的 MDV 病毒含量 的 5 万倍,表明 MDV 在 REV 感染的 CEF 中的复制能力被显著抑制。 根据MDV基因组上易插入REV的LTR的高频位点的序列合成7条引物,根据REV 的 LTR 合成 4 条引物,由此交叉组成 28 对引物,分别从两个 MDV 野毒株 GX0101 和 GD0202 中扩增和克隆到已整合进 MDV 基因组的 REV-LTR 序列及其相连的 MDV 序列。 测序证明,二株中的 REV-LTR 插入序列及在 MDV 基因组中短独特序列(US)上的插 入位点完全相同。这表明,这二个毒株很可能是一次重组事件在鸡群中形成的流行毒株。 这是国内外首次从病鸡中分离和鉴定到整合有 REV-LTR 的重组 MDV 野毒株的报道。 本文运用差异表达显示技术(Differential Display Polymerase Chain Reaction, DD-PCR)的方法对我们分离和鉴定的含有禽网状内皮组织增生病病毒成分的 MDV 天 然重组毒株 GX0101 和 GD0202 进行病毒基因差异表达的研究。结果表明 GD0202 的 gB 糖蛋白基因和 GX0101 的肿瘤相关的 1.8KB mRNA 为差异表达基因。 在对分离和鉴定到的两株MDV天然重组毒株GX0101和GD0202进行致病性试验 中,1 日龄雏鸡分别接种 GX0101 和 GD0202 以及 GA 株,在接种后 21 日龄、38 日龄、 76 日龄和 94 日龄分别采血、称重和进行病理组织学检查。结果表明,GX0101、GD0202 和 GA 株的致死率为 64%、38%和 33%,接种鸡最早的死亡时间分别为 22 日龄、54 日龄和 48 日龄;3 种 MDV 引起的病变主要为内脏肿瘤型和皮肤肿瘤型,极少见神经肿 瘤型;组织学检查表明 GX0101 在 14 日龄就已经出现显著的病理变化;而 GD0202 在 21 日龄才能在组织中看到肿瘤细胞团。3 种 MDV 中以 GX0101 对鸡的体重增长和免疫 器官抑制影响最大,其次是 GD0202 和 GA。鉴于 GX0101 的致死率显著高于强毒参考 株 GA,可以推测 GX0101 可能为超强毒株,但尚需进一步鉴定。同时,本文还比较了 REV 共感染对 MDV 重组毒株 GX0101 和 GD0202 致病性的影响。结果表明,共感染 REV 后,94 日龄时 GX0101 和 GD0202 的致病性分别为 78%和 48%,最早出现死亡的 时间分别为 17 日龄和 48 日龄。感染后 21 日龄、38 日龄和 76 日龄时,单独接种 GX0101 和 GD0202 鸡的体重分别为 168、308、958 和 171、454、1039 克;而共感染 REV 同日 龄
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S852.65

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