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《山东农业大学》 2004年
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建立梨离体叶片不定芽高效再生及基因转化体系的研究

赵瑞华  
【摘要】:梨(Pyrus communis L.)是世界上最重要的作物之一。梨白粉病和火 疫病等真菌病害是世界梨产区广泛发生的病害,感染真菌性病害严重的会 造成树体死亡,因此通过选育抗病品种的途径来解决梨因真菌感染而造成 的问题具有重要的经济意义。本研究的目标就是建立梨离体叶片高效再生 体系,并利用天然的植物转基因系统——根癌农杆菌介导,以梨品种“丰 产”(Fertility)为试材,在绿色组织特异表达的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶 /加氧酶的激活酶(Rubisco-activase)启动子(RCAP)驱动下,将抗真菌 ?-硫堇蛋白(?-thionin)Rs-afp1 基因和 uidA(gus)基因导入离体叶片, 获得 nptⅡ抗性植株,培养新的抗病品种。 试验研究了基本培养基、激素配比、细胞分裂素、生长素、培养基添 加物、蔗糖浓度、pH 值及叶龄与接种方式对梨离体叶片不定芽再生的影 响,优化了再生条件,建立起了高效、稳定的离体叶片再生体系。结果表 明,NN69 的基本培养基在诱导梨离体叶片再生方面明显优于 MS、LE 和 C;合适的激素配比及浓度是提高离体组织再生不定芽频率的关键;NAA 比 IBA 有更强的诱导梨离体叶片再生的活性;外植体的基因型显著影响 不定芽再生,金花和丰产的再生频率较高,可达 90%以上;分化培养基中 添加 AgNO3和 CH,能够促进不定芽的再生;黑暗诱导处理也影响再生, 接种后暗处理 20d,再生频率最高。在 NN69+BA5mg/L+NAA0.3mg/L+ AgNO34.5mg/L+CH300ppm+蔗糖 3%的培养基上,金花和丰产的再生频率 最高,分别为 100%和 95.3%。不定芽伸长时改用增殖培养基 MS 附加 BA1mg/L、IBA0.2mg/L。芽长至约 0.5cm 时转到含 IBA0.3mg/L 的生根培 养基上,20 天后即可长出白色细长的根,然后将再生苗移栽到砂石中炼 苗,成活率可达 85%。 在建立高效的梨离体叶片不定芽再生体系基础上,研究了梨转化过程 中影响转化的诸因素,初步建立了梨的遗传转化系统。优化过程如下:取 新展开的试管苗幼嫩叶片接种于诱导培养基上预培养 1d,用携带目的基 2 WP=8 山东农业大学硕士学位论文 因的农杆菌 EHA105 浸染 30min,然后放置到添加 20μM AS 的诱导培养 基上共培养 3d,除菌后,移入预筛选培养基(NN69+BA5mg/L+NAA0.3 mg/L+AgNO34.5mg/L+CH300ppm+Carb 250mg/L+Cef250mg/L)预筛选3d, 再移入筛选培养基(预筛选培养基附加 Kan25mg/L)进行筛选,最后得到 15 个抗性芽。转化体经 PCR 和 Southern blot 杂交检测,证实了 ?-硫堇蛋 白 Rs-afp1 基因和 gus 基因已经整合到梨的染色体组上。gus 染色证实了 RCAP 启动子在梨组织中的特异性表达。目前,转基因植株已移栽于大田, 正在进行农业性状鉴定。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S661.2

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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