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《山东农业大学》 2004年
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中国株J亚群禽白血病病毒全基因组序列的测定与分析

吴永平  
【摘要】:J亚群禽白血病病毒(Subgroup J of Avian leukosis viruS,ALV-J)是90年代初由英国鉴定出来的禽白血病病毒(ALV)新的亚群,主要引起肉鸡的骨髓瘤白血病。近年来该病毒在世界范围内迅速传播。我国于1999年首先在肉用型鸡群中分离鉴定出了ALV-J的中国株(杜岩,崔治中等,1999),并通过接种1日龄雏鸡发现了一株急性转化型毒株。此后,又在中国分离出了更多的毒株(张志,崔治中等,2002)。 网状内皮组织增殖病(reticuloendotheliosis,RE)是指由网状内皮组织增殖病病毒(ReticuloEndotheliosis virus,REV)引起的一群病理综合症。根据病原分离和血清学的结果,表明REV是呈世界性分布的。REV不仅能引起感染禽只生长迟缓、废弃淘汰率升高和死亡,还能引起感染鸡的免疫抑制。 本研究共进行了三个试验。试验1,运用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction PCR)方法扩增并克隆了在中国分离得到的反转录病毒J亚群禽白血病病毒NX0101株的前病毒全基因组序列并完成了序列测定,并与已发表的ALV-J的病毒序列进行比较。根据已报道的ALV-J前病毒基因组序列设计了8对重叠引物,通过PCR方法扩增出ALV-J/NX0101株的不同cDNA片段,分别克隆到DMD18-T载体中,转化受体菌TG1,酶切鉴定阳性克隆,并对阳性克隆测序,最后拼接出NX0101株的全基因组核酸序列。试验2,探索了对REV特异性的杂交瘤细胞株11B154的最佳生长和抗体分泌条件。以每毫升培养液中平均含0.65×10~6个/ml活细胞起始,于37℃下在含7%CO_2的培养箱中继续培养。在24、48、72和96小时后,每毫升培养液平均总细胞数和活细胞数(百分比)分别是:1.13×10~6和1.03×10~6(活细胞占94.5%)、3.42×10~6和2.48×10~6(活细胞占72.5%)、2.6×10~6和0.98×10~6(活细胞占37.7%)及2.47×10~6和0.53×10~6(或细胞占21.5%)。同时用细胞培养上清液对REV感染的鸡胚成纤维细胞作间接荧光抗体试验,在培养24、48、72和96小时后上清液中平均抗体效价分别是1:67、1:133、1:67及1:33。试验3,为了模仿REV垂直感染鸡胚,在1和3日龄的发育SPF鸡胚人工接种不同剂量的REV,并继 山东农业大学硕士学位论文 续孵化至12日龄。将发育鸡胚制成成纤维细胞单层后,再用抗REV单克 隆抗体11Bll8作间接荧光抗体反应检测REV。 试验1结果表明,该毒株的cDNA基因组有7682个碱基,共编码2560 个氨基酸。ALv一J的主要基因和基因组功能片段是5’LTR、gag基因、pol 基因、env基因、3’LTR,上述各个基因产物及基因组功能片段又包括若 干个亚片段。本研究将中国野毒株Nxo 101与英国病毒株HPRS一103及美国 病毒株 ADOL一7501的各基因片段做了比较(NX0101与HPRS一103、NX0101 与ADOL一7501、HPRS一103与ADOL一7501,以下比较均按此顺序)。5’LTR 的核甘酸序列同源性为96.6%、92.9%、93.8%。5’LTR区由U3、R、 U5构成,对这三个基因片段进行比较,其同源性分别为94.6%、89.7%、 93.8%;100%、100%、100%;95.0%、95.0%、92.5%。5’UTR的核 甘酸序列同源性为95.8%、95.0%、94.7%。 gag基因的氨基酸序列同源性为94.7%、94.7%、99.9%。gag基因 负责编码病毒内部结构核衣壳蛋白,主要有:p19、pZ、plo、p27、plZ、 p15。对gag基因的不同编码产物与即RS一103和ADoL一7501的相应基因序 列作比较,其同源性分别为96.1%、92.9%、94.2%;100%、100%、 100%;96.8%、98.4%、98,4%;94,1%、95.0%、97.1%;93.3%、 92.1%、95.5%:96.0%、96.0%、98.4%。 pol基因编码一种反转录酶,其氨基酸序列同源性为97.7%、97.6 %、98.6%。pol基因的编码产物是RTp68和IN p32。对pol基因的不同 编码产物做了比较,其同源性为97.2%、97.6%、99.0%;98.9%、97.5 %、98.6%。 囊膜蛋白env基因的同源性为91、8%、86.5%、87.6%。env基因由 gp85基因和gp37基因组成,对其氨基酸序列作比较,同源性为90.3%、 80.1%、83.1%:93.4%、94.4%、91.9%。 3’LTR的核甘酸序列同源性为95.0%、90.6%、94.2%。3’LTR区 由U3、R、US构成,对这三个基因片段进行比较,其同源性分别为%.0 %、90.7%、93.8%;100%、100%、100%; 91.7%、91.7%、93.6%。 3’UTR基因的核甘酸序列同源性为84.5%、64.8%、91.4%。3’UTR 基因包括DRI基因和E二X基因。通过比较发现,NX0101毒株的DRI区 吴永平中国株J亚群禽自血病病毒全基因组序列的测定与分析 缺失62个碱基,E二X基因缺失65个碱基。由以上分析可知,我国 ALV一J/N XO 101株的基因组全序列基本类似于已发表的其它ALv一J病毒株。 在比较的三个毒株中,NX0101株与HRPS一103和ADOL7501毒株并不呈现 同步变化。ALV一J/NX0101株前病毒全基因序列的测定,这为进一步研究 和追踪我国鸡群中ALV一J的演变规律提供了基本的分子数据,也有助于了 解中国流行毒株与国际上其他流行株间的演化关系。 试验2结果表明,以培养48小时后,当细胞总数及活细胞总数最高但 活细胞百分比开始下降时的培养液中抗体效价最高。该研究结果可作为在 细胞培养上大批量生产抗REV单抗的技术参数。 试验3结果表明,从所有人工感染尺EV的鸡胚12日龄制备的成纤维细 胞
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【同被引文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前1条
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