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《山东农业大学》 2004年
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新城疫快速诊断金标试纸条的研制及初步应用

高玲美  
【摘要】:本研究以胶体金标记鸡抗新城疫(ND)抗体(IgG),兔抗ND IgG和兔抗鸡二抗包被于硝酸纤维素膜上,研制出了快速诊断鸡NDV的免疫层析金标试纸条。将试纸条插入被检样品中,利用滤膜的层析作用,使加在膜一端的样品,向另一端移动,在移动过程中发生抗原(Ag)与抗体(Ab)反应,产生肉眼可见的红色条带。如果试纸条上出现两条红色条带则证明结果为阳性,如果只出现一条红色条带则结果为阴性。 本实验共分为以下六部分: 第一部分 NDV的培养及纯化 将NDV接种于SPF鸡胚,72h左右收集NDV尿囊液,并通过差速离心法和层析方法分离纯化NDV备用。 第二部分 鸡抗ND血清和兔抗ND血清及其IgG的提取 根据设计好的免疫程序,用Lasota系弱毒疫苗对SPF鸡进行点眼滴鼻,同时用自制的ND灭活疫苗进行胸部肌肉注射,当抗体滴度达到所需水平时,获得ND单因子血清。用上述纯化的NDV对兔子进行背部多点注射获得兔抗NDV血清。并用辛酸-硫酸铵法提取鸡抗ND IgG及兔抗ND IgG。 第三部分 胶体金的制备 将所需容器按要求用5%的二氯二钾硅烷的氯仿溶液清洗后进行胶体金的制备。胶体金中加入0.02%的Na2N3,经一次性灭菌滤器过滤,装入洁净的玻璃瓶中备用。 第四部分 免疫胶体金的制备(金标鸡抗ND IgG的制备) 将待标记的鸡抗ND IgG和胶体金处理好后,确定胶体金与待标记IgG用量的比例。当确定好两种试剂的最适用量比例后,分别取所需的胶体金和相应量的抗体蛋白溶液混合,加入5%的BSA作为稳定剂使其最终浓度为1%,并用超速离心法进行胶体金标记蛋白的纯化。 第五部分 试纸条的制备 将硝酸纤维素膜用0.1mol/L的EDC溶液活化后将兔抗ND IgG和兔抗鸡二抗包被其上,再将玻璃纤维进行预处理,将40ul左右的金标鸡抗ND IgG喷涂于玻璃纤维上,裁取一定大小的吸水纸、将吸水纸、包被好的硝酸纤维素膜、喷涂玻璃纤维从上到下依次固定于不干胶底板上即成试纸条。 第六部分 金标试纸条的各项指标检验 通过特异性实验,敏感性实验,重复性实验和稳定性实验以及对实验感染鸡的检测对所制备的试纸 条进行检验。检测结果表明本实验研制的新城疫快速诊断试纸条特异性 WP=10 强、重复性好、操作简便快速。由于本法不需要特殊试验条件,结果客观、准确,肉眼易于判断,所以是一项很有开发、推广应用前途的新技术。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S859.79

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