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《山东农业大学》 2005年
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鸡X期胚盘细胞体外培养与输卵管生物反应器的研制

张传生  
【摘要】:鸡输卵管生物反应器研制已成为转基因研究热点之一。人们尝试应用多种方法研制鸡输卵管生物反应器,但至今没有取得令人满意的效果。因此探索更为有效的转基因鸡制备途径已成为目前研究的一个重要课题。应用鸡内源性的调控元件指导外源基因在鸡输卵管特定的表达是研制鸡输卵管生物反应器的一种全新策略,需要对家禽多能细胞体外长期培养和遗传修饰。因此本研究首先对胚盘细胞的进行体外培养、标记,探索对鸡早期胚盘细胞遗传修饰技术,继而构建可用于输卵管生物反应器研制的表达载体,取得如下结果: 1.克隆寿光鸡cENS2基因的U3R调控区,序列分析表明该调控区含有CES细胞特异的增强子B区;U3R调控区与pEGFP-N载体融合构建了鸡CES细胞特异表达载体pEGFP-cENS2-Promoter,通过转染胚盘细胞、CEF细胞验证其特异的启动子活性。 2.应用pEGFP-cENS2-Promoter转染不同区域的胚盘细胞从而从分子水平确定CES细胞或其前体细胞主要分布在胚盘明区。 3.以pEGFP-N作为阳性对照,应用pEGFP-cENS2-Promoter载体转染胚盘单层细胞并进行G418药物筛选,表明体外培养一周胚盘细胞依然具有部分细胞的干细胞特性,但难以获得增殖性能强的稳定整合的细胞克隆。 4.以BRL-3A细胞条件的基础培养基添加2%鸡血清,0.1mMβ-巯基乙醇,2mML-谷氨酰胺,10mM HEPES(PH7.6),100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,10ng/ml庆大霉素,20ng/ml伴白蛋白,胎牛血清及细胞因子为配制CES完全培养基,结合应用小鼠成纤维细胞饲养层,分离获得短期传代(3代)的具有胚胎干细胞表型(PAS、AKP染色阳性)的细胞克隆。 5.应用pEGFP-cENS2-Promoter载体对分散成单个X期胚盘细胞进行瞬时转染,应用CES完全培养基联合SNL饲养层对转染后的细胞继续培养、并进行G418筛选,可以延长标记细胞的体外培养时间,为对细胞遗传修饰奠定了技术条件。 6.以pLNHX载体为骨架,切去HSP70启动子同时插入OV-INF-IRES2-EGFP-PolyA表达盒,构建了两个(正反向)卵清蛋白基因启动子指导的猪β干扰素和绿色荧光基因共表达的逆转录病毒表达载体命名为pLNHX-OV-INF-IRES2-EGFP(±),测序验证表明各组件连接正确。 7.通过电泳阻滞实验确定DNA与PEI的N/P=3,配制pLNHX-OV-INF-IRES2-EGFP(+)/PEI溶液经翅静脉体内转染产蛋鸡,通过RT-PCR证明目的基因在输卵管
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q78;Q813.1

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【参考文献】
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