马铃薯Y病毒HC-Pro基因及其突变体介导的转基因植株抗病性研究

【摘要】：马铃薯Y 病毒编码的辅助成分蛋白酶(HC-Pro)具有多种功能,如蛋白酶活性、病毒移动、抑制基因沉默和辅助蚜虫传毒功能等。在本研究中,通过PCR 方法,获得了该基因的三个缺失突变体,连同完整基因构建了四种植物表达载体,通过土壤农杆菌介导法转化了烟草品种NC89。对这四种转基因植物进行了抗病性、分子生物学及生物学鉴定和比较。在细菌菌株BL21 中表达了HC-Pro 基因和一个突变体,并用原核表达的蛋白免疫家兔制备了抗血清。具体结果如下: 1.以本实验室分离克隆的PVYN HC-Pro 基因为模板,设计突变体引物, 通过PCR 获得可翻译C 端区域(HC-C,598 bp),非翻译C 端区域 (HC-C’,599 bp),缺失中间区域的可翻译HC(HC-NC,1003 bp) 3 个缺失突变体。将全长HC 基因和3 个突变体片段克隆到载体pUC18 的BamHI 和KpnI 之间,并经过序列测定证实。分别用BamHI 和KpnI 从重组克隆载体上将全长HC 基因和各突变体片断切下,插入植物表 达载体pROKⅡ35S启动子下游,构建了4个植物表达载体pROK-C、 pROK-C’、pROK-NC 和pROK-HC,转化农杆菌后用于普通烟的转 化。 2.通过农杆菌介导法将含有外源基因的土壤农杆菌LBA4404 和普通烟草 NC89 叶盘共培养,在含有卡那霉素的MS 培养基中选择,获得了转基 因的烟草植株,通过PCR 检测证明分别获得HC-C、HC-C’、HC-NC 和HC转基因烟草121、116、124和130株。 3.用PVYN 对转基因植株攻毒,两周后,第一次接毒不发病的植株进行 二次攻毒,再过两周后ELISA 检测植株内病毒浓度。结果表明从用 C、C’、NC 和全长HC 转化的植株中分别获得抗病植株6、15、8 和3 棵。 4.饥饿2h 的桃蚜在推迟发病型植株上取食5 分钟后,转移到非转基因植 株上,进行传病毒实验。结果表明,转HC-N、HC-NC 基因(转 HC-N 的烟草植株由实验室另一位同学提供)的植株能降低蚜虫传病 毒效率,转HC-C和全长HC基因的植株对蚜虫传毒没有影响。 5.用BamHI 和SacI 分别从重组pUC18 载体上将HC 和HC-C 片段切下, 插入原核表达载体pET-22(b+)的T7 启动子的下游,利用酶切鉴定得 到含有HC 的重组子pET-HC 和含有HC-C 的重组子pET-C。重组子 转化大肠杆菌BL21,培养并通过IPTG 诱导后,HC 和HC-C 在原核 中得到大量表达。从SDS-PAGE 凝胶中切下目的蛋白带,作为抗原免 疫家兔制备了抗血清。得到的抗血清在琼脂免疫双扩散、ELISA 和