鸡新城疫荧光PCR检测方法的建立及应用

【摘要】：鸡新城疫是由鸡新城疫病毒引起的急性、高度接触性、烈性传染病,对养禽业危害极大。NDV传统的确诊方法主要依赖病毒的分离鉴定及血清学检测(主要包括鸡胚中和试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等方法),这些方法耗时长、灵敏度低且经验依赖性强。PCR是一种快速准确的检测方法,但产物需经琼脂糖凝胶电泳和溴化己锭(EB,致癌物)染色等,易产生污染和假阳性。现代化生产需要建立一种快速、准确、高效的检测方法。 实时荧光PCR技术是一种新型的核酸检测技术,在临床诊断中已经用于细菌、病毒及遗传性疾病的检测,具有极大的应用价值。本研究根据荧光PCR检测原理,利用荧光双链引物建立了鸡新城疫病毒毒实时荧光PCR检测方法。 本课题分为三个部分进行研究。 第一部分 鸡新城疫F蛋白基因的克隆 根据GenbankNDVF糖蛋白mRNA全序列,设计了一对特异引物(P1∶5’-CTTGAC ACC TCATAC TGT AT—3’.P2∶5’-CCC AAG CCA TAA TAAGGT CTT-3’)。提取NDV种毒RNA进行反转录,以反转录产物作为模板,利用上述一对引物进行PCR,结果只有以NDV种毒反转录产物为模板可以扩增出623bp的特异条带。紫光灯下切割特异性条带并用V—gene试剂盒进行纯化。纯化产物与pMD 18-T Simple Vector连接,连接产物转化感受态细胞JM109,经蓝白斑筛选和PCR鉴定后,进行测序。结果表明该NDV毒株的F蛋白基因序列与Genebank公布的序列有99%的同源性。