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《山东农业大学》 2006年
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犊牛轮状病毒的分离鉴定及快速诊断方法的建立

栾婧婧  
【摘要】: 牛轮状病毒是引起犊牛腹泻的主要病原,犊牛感染轮状病毒后,由于胃肠道的功能紊乱而导致生长变缓,而持续性腹泻容易导致机体脱水,甚至休克死亡。自1982年在中国分离到水牛轮状病毒以来,相继在中国分离到猪、兔、鸡的轮状病毒。引起犊牛腹泻的轮状病毒主要为A群轮状病毒,根据其中和抗原VP7的差异可将轮状病毒分为不同的血清型(G1~G14)。美国学者ANITL V PARWANT等1993年采用核酸探针检测犊牛轮状病毒,试验结果证实G6血清型占检测样本总量的36.8%(37/102),G8血清型为2.9%,12.7%为G10血清型。目前,国内对牛轮状病毒的研究还仅仅停留在病原的分离上,对轮状病毒在细胞内的病理变化和轮状病毒的快速诊断方法尚属空白。 本研究从山东暴发犊牛腹泻的地区采集腹泻犊牛的粪便,接种MA-104细胞后,连续传代后分离到一株轮状病毒,并对其生物学特性进行了初步的研究。该毒株为山东分离到的首株犊牛轮状病毒,分离到的牛轮状病毒传至第4代出现明显的细胞病变,该轮状病毒能在MA-104细胞上稳定繁殖,传代。 将该轮状病毒分离株在MA-104细胞上传至27代,病毒培养28-36h后出现明显的细胞病变。电镜下病毒粒子具有光滑的囊膜和车轮状结构,具有典型的轮状病毒的结构特征。对轮状病毒在细胞内的增殖情况进行研究发现轮状病毒在细胞内可以大量增殖,同时细胞出现线粒体肿胀,细胞膜溶解破裂等微观的病理变化,但试验中发现轮状病毒在接种细胞时,可以成功在感染的细胞内进行高倍数增殖的病毒量并不多,可能与轮状病毒特殊的培养条件有关。 轮状病毒的VP7基因组由1062个核苷酸组成,编码323个氨基酸,在不同血清型之间具有严格的保守性,根据在NCBI上已发表的NCDV标准株和IND参考株VP7基因序列,用DNA Star软件Meglign对其进行分析后,使用RT-PCR方法扩增VP7基因和G6、G8、G10的特异性基因,并针对各血清型的相对保守区设计的引物,扩增A群轮状病毒各血清型的特异性片段。本次试验首次使用A群轮状病毒不同血清型的特异性引物,扩增各血清型的特异性片段,对分离到的轮状病毒进行血清型的鉴定。在研究中分离到的轮状病毒使用分子生物学方法进行血清型的鉴定,其中用G8、G10特异性引物没有扩增出目的片段,通
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S858.23;S854.4

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