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苹果α-法尼烯合成酶基因表达载体的构建及遗传转化

吕慧贞  
【摘要】: 虎皮病是苹果、梨在低温贮藏中后期发生的最严重的生理病害之一,这种生理病害不仅影响果实的食用品质特别是外观品质,降低其商品价值,而且使果实抗病性降低,易感染病菌而腐烂,从而造成巨大的经济损失。实验证明α-法尼烯是诱导虎皮病发生的重要因素。果皮中α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径,调控此途径的酶包括3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),法尼基焦磷酸合成酶(FPPS),α-法尼烯合成酶(AFS)。其中AFS是调控α-法尼烯合成的最直接的限速酶,它催化法尼基焦磷酸(FPP)转变为α-法尼烯。我们可以通过基因敲除方法调控此基因的表达,从而调控α-法尼烯的合成。 根据α-法尼烯合成酶基因全长序列设计特定引物,构建正义和RNAi载体,转化烟草和苹果,研究α-法尼烯的表达情况;研究影响苹果离体叶片的再生因子,完善苹果再生体系;利用根癌农杆菌介导,转化苹果,筛选苹果新品种。主要结果如下: 1.利用RT-PCR方法,从苹果果皮中克隆苹果α-法尼烯合成酶基因(AFS)。 2.构建了pBI-AFS正义表达载体,并转化烟草,得到转AFS基因的烟草。 3.利用构建pET-AFS原核表达载体,转化大肠杆菌,制备抗体,western杂交结果显示该基因在烟草中成功表达。 4.构建α-法尼烯合成酶基因RNAi表达载体,进行苹果的遗传转化。 5.通过研究基本培养基、激素配比、蔗糖浓度等对苹果离体叶片再生不定芽的影响,优化再生条件,完善苹果再生体系。 6.在建立高效的苹果再生体系基础上,研究了苹果转化过程中的影响因子,初步建立了苹果的遗传转化系统。


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