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《山东农业大学》 2006年
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卵丘细胞对小鼠卵母细胞胞质成熟的作用及机理的研究

葛丽  
【摘要】: 获取高质量的体外成熟卵母细胞是成功进行人类体外受精、动物胚胎生产和克隆的关键。尽管动物卵母细胞能够在体外自发完成细胞核成熟,但卵母细胞成熟质量远不如体内成熟卵母细胞,其受精后胚胎发育能力较差。目前认为,这可能是由于体外成熟的卵母细胞胞质成熟不充分造成的。研究表明,卵母细胞体外成熟培养系统与受精率和囊胚发育率有强相关性。所以,继续深入认识卵母细胞的成熟规律、改善体外成熟培养环境、建立一种完善的卵母细胞体外成熟系统是当前胚胎工程研究的重要内容之一。尽管研究证明,卵泡细胞在卵母细胞胞质成熟过程中起到了重要的作用,但对于不同类型细胞发挥的具体作用以及作用机制的理解还比较匮乏。在本研究中,我们建立了一种小鼠裸卵与卵丘细胞共培养的实验模型,主要研究目的有两点:第一,深入探讨卵丘细胞支持卵母细胞胞质成熟的作用机制;第二,通过改善体外成熟培养系统,最大限度的提高裸卵的体外成熟及发育能力,为生发泡移植和GV期卵母细胞冷冻保存等技术提供有效的裸卵成熟方法。本论文主要探讨了体细胞类型、卵丘细胞与卵母细胞之间的接触及缝隙连接以及促性腺激素对共培养效果的影响;研究了成熟促进因子(MPF)活性和卵母细胞核成熟进程对小鼠卵母细胞胞质成熟的影响;观察了透明带硬化、皮质颗粒(CGs)的重分布及胞吐、谷胱甘肽(GSH)含量、纺锤体的组装和线粒体的分布等反应卵胞质成熟的指标。结果表明: 1.体外成熟的小鼠卵母细胞,其最佳孤雌激活卵龄为培养26小时,最佳激活方案为含10mM SrCl2和5μg/ml CB的CZB激活处理2.5小时,之后转入含5μg/mlCB的CZB中继续培养3.5小时。 2.与卵丘细胞单层共培养能够显著提高裸卵(DOs)的成熟率和囊胚发育率,与输卵管上皮细胞或胎儿成纤维细胞单层共培养仅仅能够提高DOs的核成熟率,壁颗粒细胞对DOs的核成熟和发育无作用。对卵丘细胞来讲,来自GV期卵母细胞的卵丘细胞其支持DOs成熟及发育的能力要显著好于从MII期卵母细胞中获得的卵丘细胞。 3.卵丘细胞与卵母细胞之间不需要紧密接触,卵丘细胞单层条件化培养液也能提高DOs的成熟和发育能力。 4.DOs与卵丘卵母细胞复合体(COCs)或分散卵丘细胞(DCCs)共培养时,随着卵丘细胞密度的增加,共培养的效果也越发明显。 5.取卵前如果将注射PMSG的刺激时间从46小时缩短到24小时,体外成熟的卵母细胞的胞质成熟质量显著降低;与卵丘细胞共培养能显著提高注射PMSG后24小时取卵的COCs和DOs的胞质成熟能力;共培养系统中,如果卵母细胞成熟培养液中缺少PMSG,这将会严重削弱卵丘细胞支持卵母细胞胞质成熟的能力。 6.尽管体外成熟的COCs与DOs的GSH水平差异不显著,但共培养也能够提高DOs的受精能力。 7.通过DOs与卵丘细胞共培养,能够反映卵母细胞胞质成熟的其它一些指标也得到了一定程度的改善。与卵丘细胞共培养的DOs(coDOs),其核成熟进程及MPF活性较DOs单独培养时更加接近于体内成熟卵的情况。与卵丘细胞共培养能够显著降低DOs的CGs发生成熟前胞吐的几率;与卵丘细胞共培养能够有效地缓解DOs的透明带硬化程度;coDOs与DOs相比,具有正常纺锤体形状的卵母细胞的比例显著增加,具有完全极化线粒体分布状态的卵母细胞的比例显著增加。 综合上述研究结果说明,卵丘细胞以组织特异性和激素依赖性方式产生了一种或一些可溶性因子,这些可溶性因子可能通过调控卵母细胞的MPF活性和减数分裂进程来促进卵母细胞的胞质成熟。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q813

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