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《山东农业大学》 2007年
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人干扰素-β在生菜中的表达、鉴定和生物活性研究

李静  
【摘要】: 随着分子生物学和遗传转化技术的发展,利用转基因植物生产人或动物基因工程药物蛋白已成为植物基因工程的一个新兴研究领域。与目前的细菌、酵母及哺乳动物细胞等传统药物蛋白生产系统相比,用转基因植物生产基因工程药物蛋白具有其独特的优势:成本低,可以以农业化的规模生产昂贵的生化药物;完整的真核细胞表达系统,使表达产物具有较好的生物活性;安全性好,无外源性病原污染;口服植物疫苗能诱导粘膜免疫反应,生产简便、成本低廉,不需要冷藏和低温运输。但植物表达存在表达量低、下游分离纯化困难等严重问题,因此寻找新的转基因植物受体,开发新的植物表达系统,成为植物生物反应器研究的重点。 本研究以叶用生菜(Lactuca sativa L.sp)为试验材料,探讨优化生菜农杆菌真空渗透瞬时转化方法和稳定转化组织培养体系,采用瞬时转化方法将四种不同的干扰素-β基因转入生菜中,研究生菜瞬时表达干扰素-β的水平和生物活性,获得结果如下: 1.对生菜的瞬时表达方法进行了系统优化,建立了适宜生菜高效瞬时表达的转化体系(200μmol/L乙酰丁香酮、0.8OD600菌液密度、真空处理30min、共培养6d)。以条件A1B1C1D1(0μmol/L乙酰丁香酮、0.4OD600菌液密度、真空处理10min、共培养2d)为对照,应用结果表明:优势组合的GUS表达水平为21.39nmol? mg-1? min-1 MU,比对照(1.31 nmol? mg-1? min-1 MU)提高16.3倍。结果表明该生菜瞬时表达体系可有效的提高外源基因的表达。 2.糖蛋白药物干扰素-β在生菜叶片中成功表达为27kDa的蛋白,推测为带有植物特有糖基化形式的糖蛋白;抗病毒活性表明,该干扰素-β能抑制水泡性口膜炎病毒对人羊膜Wish细胞的攻击,这也是首次对农杆菌真空渗透瞬时表达来源的生化药物进行生物活性检测的报道。由于基因定点突变使第17位半胱氨酸改为丝氨酸(Cys-Ser),去除了Cys17对正常二硫键(Cys31和Cys141)的影响,使干扰素β的空间结构更稳定,因此,突变型的干扰素表达量和活性高于原始型干扰素。四种干扰素-β(IFN,无信号肽的干扰素-β;sIFN,有信号肽的干扰素-β;mIFN,无信号肽突变型的干扰素-β;smIFN,有信号肽突变型的干扰素-β)表达产物的活性分别为:3.1×104IU/mL,5.8×104IU/mL,6.3×104IU/mL,9.8×104IU/mL;表达量也依次升高。表明:Cys17向Ser17的改变及信号肽的添加有利于干扰素-β表达量和活性的提高,可以利用农杆菌介导的瞬时表达方法快速、大量、廉价的生产人源细胞因子、疫苗等生化药物。 3.为探讨干扰素-β在植物中的糖基化形式,构建含有糖基酶PNGase F的植物双元表达载体pBI121-F,将含有pBI121-F的农杆菌GV3101与含有pBI121-smIFN的农杆菌GV3101混合后,真空渗透转化生菜叶片,以期利用PNGase F的酰胺内切酶作用将干扰素-β的糖链切除,但通过Western检测,没有发现干扰素-β分子量的变化,可能是由于干扰素-β的表达量较低,不能检测到PNGase F的作用,也可能是由于植物糖基化结构中含有较多的α-1,3-岩藻糖,α-1,3-岩藻糖的位阻影响了PNGase F的酶切作用。 4.以三种不同基因型生菜(日本生菜,美国大叶速生,泰国生菜)的两种外植体(10d龄的子叶和真叶)为材料,建立了适合多种基因型生菜组织培养和植株再生体系:MS培养基添加0.1 mg/L NAA和0.1-0.5mg/L 6-BA,为不同基因型生菜的最适不定芽诱导培养基;基因型不同,所要求的激素浓度配比也不同:日本生菜的高效不定芽诱导激素配比为0.1mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA,美国大叶速生为0.3mg/L 6-BA and 0.1mg/L NAA,泰国生菜为0.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA;真叶的不定芽分化率显著高于子叶的分化率。最适的生根培养基为添加0.1mg/L NAA的MS;生菜不定芽诱导生根较易,基因型和外植体类型对生根的影响较小;基因转化中卡那霉素的适宜筛选浓度为50mg/L。生菜为强自花授粉作物,转入基因不容易丢失;生菜叶片可直接生食。该体系的建立有利于生菜的基因转化,对利用生菜稳定表达基因工程类药物奠定试验基础。 5.采用重叠延伸PCR的方法构建了与GUS基因融合的IFN基因片段,以期利用GUS的高表达带动HuIFN-β的表达。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S636.2

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