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《山东农业大学》 2007年
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兽医中药免疫增强剂的筛选试验及其药理学研究

刘翠艳  
【摘要】: 本研究旨在通过一系列体内外试验研制开发一种疗效确实的中药免疫增强剂。试验内容共分四个部分,第一部分通过体内试验制造免疫抑制模型筛选有效的中药免疫增强方剂,第二部分则对筛选出的中药免疫增强剂的急性毒性和细胞毒性进行检测,第三部分在药物的安全浓度范围内进行了大量的体外免疫学研究,第四部分又重新回到整体动物试验,重点从免疫学的角度验证了该中药免疫增强剂的免疫增强功能及机理。 第一部分中药免疫增强剂筛选试验 分别给正常小鼠和环磷酰胺(Cy)所致免疫抑制小鼠饮服中药:1个经典方剂(YPF,玉屏风散)和3个自拟方剂(TJJ1、TJJ2、TJJ3),以环磷酰胺(Cy)制造免疫抑制病理模型,以玉屏风散为对照,检测所拟中药方剂对小鼠血液学指标、体重、脏器指数的影响和脾、肝组织病理学变化,从中筛选最佳方剂。结果:(1)上述中药方剂对健康小鼠血液学指标(WBC、RBC、HGB、HCT、MCH、MCV)的影响不显著(P0.05),而对Cy所致的免疫抑制小鼠作用明显(P0.05),特别是方剂TJJ2总体效果好;(2)各中药方剂对正常小鼠体重及脏器指数的影响均不明显(P0.05),而对Cy所致的免疫抑制小鼠作用显著(P0.05),以TJJ2和YPF为好;(3)病理组织切片显示,TJJ2模型组和YPF模型组小鼠脾白髓大而明显,肝细胞轻度变性坏死;而Cy对照组脾白髓不明显,肝细胞严重变性坏死。根据上述各项指标检测结果综合认为,在3个自拟方剂中,TJJ2作用最好,可选定为后续试验的研究对象(简写为TJJ)。 第二部分中药免疫增强剂(TJJ)急性毒性及细胞毒性测定 通过体内外不同试验途径和方法测定中药免疫增强剂(TJJ)对小鼠的急性毒性和细胞毒性,以确保临床用药安全。体内急性毒性试验以半数致死量(LD50)和最大耐受量(MTD)为指标,用40g/kg体重剂量的TJJ灌胃小鼠,1wk后小鼠未发生死亡,再在小鼠可接受的最大容积下,给小鼠灌服日累积剂量为120g/kg体重的TJJ进行MTD试验,1wk后处死观察其病理变化。体外试验采用形态学观察和MTT两种方法,测试TJJ在CEF、L929体外培养中的最大安全浓度(TC0)。结果表明:(1)TJJ急性毒性很低,其LD50超过40g/kg体重,MTD超过120g/kg体重。根据毒性分级标准,可认为该免疫增强剂在短期内使用是安全的。(2)体外培养结果,TJJ对CEF和L929细胞的最大无毒浓度分别达3.12g/L和1.56g/L,为后续的体外免疫药理学研究提供依据。 第三部分体外研究中药免疫增强剂对小鼠细胞免疫及抗病毒、抗肿瘤活性的影响 首先用环磷酰胺(Cy)制造免疫抑制小鼠细胞模型,模型细胞培养和正常细胞培养同时进行,采用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞杀伤活性,并对影响MTT法的关键因素细胞密度、影响NK细胞杀伤活性的不同效靶比例和不同作用时间等条件进行了筛选优化,采用中性红染料吸收法检测小鼠腹腔Mφ吞噬功能,以探讨在体外培养条件下,不同浓度的TJJ和YPF对小鼠脾淋巴细胞转化、NK细胞杀伤活性及腹腔Mφ吞噬功能的影响。结果表明:(1)脾淋巴细胞密度在1~6×109个/L时呈指数生长,脾脏NK细胞在效靶比为50:1、作用时间在18h时能稳定和较高的反映NK细胞的杀伤活性。(2)对正常小鼠,不同浓度的TJJ和YPF对脾淋巴细胞增殖反应、NK细胞的杀伤活性影响不显著(P0.05),但能增强腹腔Mφ吞噬活性;对Cy所致免疫抑制小鼠,100~1200μg/ml的TJJ和YPF对脾淋巴细胞增殖反应、NK细胞的杀伤活性有不同程度的影响(P0.05),其中TJJ在400μg/ml时作用显著(P0.05)。 用Reed-Muench氏法进行病毒感染滴度测定,然后采用L929-VSV检测系统进行不同浓度的TJJ及YPF对VSV增殖的抑制作用研究,用微量细胞病变抑制法检测中药诱导小鼠脾淋巴细胞产生IFN-γ的活性,探讨在体外培养条件下,不同浓度的TJJ和YPF是否能对VSV的增殖产生抑制作用,以及是否能诱导小鼠脾淋巴细胞产生IFN-γ并对其活性进行检测。结果表明,(1)TJJ和YPF均不具备体外抗VSV活性。(2)TJJ和YPF诱导的脾淋巴细胞上清有一定的抗VSV活性,TJJ表现为400μg/ml时作用稍好,YPF表现为500μg/ml时作用稍好,但各浓度中药诱导的脾淋巴细胞上清均不能完全抑制VSV对L929细胞的破坏作用(P0.05)。说明在体外培养条件下,TJJ和YPF都不具备体外抗VSV活性,其诱导的脾淋巴细胞上清有一定的抗VSV作用。 采用不同浓度的TJJ与NS-1共培养,作用一定时间(12h、18h、24h、36h、48h)后加入MTT,酶标仪读取光密度值,以研究体外培养条件下不同浓度的TJJ的抗肿瘤细胞增殖活性。结果表明,各培养时间均未见TJJ有抗肿瘤细胞增值作用;随着培养时间的延长(超过24h)TJJ有一定的促进肿瘤细胞生长的作用。 第四部分体内研究中药免疫增强剂对小鼠免疫功能及抗氧化功能的影响 以Cy诱导建立小鼠免疫抑制模型,采用分光光度法检测小鼠血清半数溶血值(HC50),用MTT法检测淋巴细胞增殖反应,流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的变化,以探讨TJJ对正常小鼠及Cy所致免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响;采用胸腺细胞增殖法检测IL-2的活性,用微量细胞病变抑制法检测IFN-γ活性,探讨中药方剂对Cy所致免疫抑制小鼠脾淋巴细胞产生细胞因子的影响;并同时检测血清中的NO、MDA和SOD的含量,以观察TJJ及YPF对正常小鼠及Cy所致免疫抑制小鼠抗氧化能力的影响。结果表明:(1)Cy在SRBC免疫后引起溶血素(HC50)生成反应显著降低(P0.05),而用药组(TJJ组和YPF组)的HC50明显高于Cy组,差异显著(P0.05),且以TJJ作用为好,与YPF比差异显著(P0.05)。(2)各试验组脾细胞在48h内的淋巴细胞转化率与脾细胞中加入含药血清在相同培养时间内的淋巴细胞转化率所表现的结果有完全一致的趋势,即TJJ和YPF对免疫功能异常的小鼠脾淋巴细胞具有明显的促转化功能,TJJ组和YPF组淋转值明显高于正常对照组和Cy组(P0.05),且TJJ组优于YPF组(P 0.05);另外,TJJ和YPF可以明显提高免疫抑制小鼠CD3、CD8水平,降低由于Cy引起的CD4/CD8升高的比值,与模型组比较差异显著(P0.05)。(3)胸腺中淋巴细胞增殖反应的最适细胞密度为3~8×109个/L;试验各组小鼠脾淋巴细胞诱导上清在1:4~1:32的稀释度下表现为较强的IL-2活性,中药组与模型对照组差异显著(P0.05),Cy+TJJ组诱生的IFN-γ活性最高(8.1414±0.5589)㏒ 2,与对照组差异显著(P0.05);(4)TJJ及YPF可明显降低正常小鼠及Cy所致免疫抑制小鼠血清中的NO、MDA含量,提高SOD的含量(P0.05),说明TJJ具有较好的抗氧化功能和免疫增强功能。 结论(1)该中药免疫增强剂(TJJ)毒性极小,使用安全。(2)根据所获得的各项检测结果,综合认为,TJJ可显著增强机体的免疫功能和抗氧化功能,特别是对机能紊乱的机体更明显。(3)TJJ的作用优于YPF。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S853.7

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