萝卜春化过程中的生理生化变化及开花基因LFY的克隆

【摘要】： 中国萝卜(Raphanus sativus L.var. longgpinnatus Bailey)是原产于中国的一种重要蔬菜,我国萝卜种植面积在120万ha左右,位居各种蔬菜种植面积的前三位。目前,限制萝卜周年生产和均衡供应的瓶颈问题是缺乏耐抽薹萝卜种质,这也是生产中经常出现先期抽薹而造成重大损失的根本原因。因此,探明萝卜耐抽薹机制,将分子育种技术与传统育种技术有机的结合起来,创新萝卜耐抽薹种质,对加速我国萝卜育种进程具有重要理论和实践意义。本试验研究了萝卜春化过程中生长点的生理生化变化、萝卜高效遗传转化体系的建立,并克隆了开花关键基因LFY。主要试验结果如下: (1)低温处理过程中,抽薹性差异较大的两个品种短叶十三和长春大型可溶性蛋白、游离氨基酸、可溶性糖含量变化趋势基本一致。可溶性蛋白、游离氨基酸含量总体表现为逐渐升高的趋势,而可溶性糖含量则呈下降趋势。耐抽薹的萝卜品种长春大型,其可溶性蛋白和可溶性糖含量明显低于短叶十三,游离氨基酸含量则相反。两品种赤霉素(GAs)、生长素(IAA)的含量在花芽分化开始时均有较明显的峰值,在处理后期又出现另一明显峰值。 (2)通过对影响转化效果的诸因素的研究,初步筛选出适宜萝卜品种短叶十三真空渗入的遗传转化体系:真空渗入时间为104pa负压条件下连续处理10 min,菌液浓度OD600为0.8~1.2,渗入培养基为1/2MS无机+B5有机+6-BA 0.04 mg·L-1+AS 19.6 mg·L-1,在蕾期对花蕾进行真空渗入。(3)以萝卜品种短叶十三的花蕾为材料,通过RT-PCR的方法,克隆了开花关键基因LFY部分cDNA序列,和已公布的大白菜LFY基因具有93%以上的同源性,将此序列以相反方向先插入到分子量较小(2686 bp)的中间载体pUC19上,并在两片段之间插入小麦乙酞辅酶A的第20个内含子,再将连接好的三个片段酶切后插入到植物表达载体pROK2 35S启动子之后,从而构建了双元dsRNA抑制载体,并通过真空渗入遗传转化法转入到弱冬性萝卜短叶十三试材中。