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《山东农业大学》 2008年
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番茄类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及功能分析

孙卫红  
【摘要】: 逆境胁迫是目前农业生产上面临的严峻问题之一,也是蔬菜设施栽培中常见的问题,可导致作物生长发育受抑制,产量和品质降低。当作物生长的外在条件如温度、土壤水分、盐浓度等发生急剧变化或紫外线辐射、某些除草剂等作用于植物时,都会导致植物体内产生大量的活性氧。活性氧可引起蛋白质、膜脂和其他细胞组分的损伤,进而导致细胞及组织死亡。活性氧主要包括过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)、单线态氧(1O2)、超氧阴离子(O 2)等。叶绿体抗坏血酸过氧化物酶(chlAPX)包括叶绿体基质抗坏血酸过氧化物酶(sAPX)和类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶(tAPX )两种,它对于保护叶绿体和其它细胞组分免受H2O2和由它产生的·OH破坏作用是必须的。因此研究逆境胁迫下APX基因与植物抗逆性的关系具有重要意义。 本研究从番茄叶片中克隆到LetAPX并转化到烟草中,选用野生型烟草(WT),转正义LetAPX基因株系后代T2-2(+)、T2-3(+)和T2-6(+),研究了逆境胁迫下过量表达LetAPX基因的烟草后代抗氧化及抗逆性能力的变化。表达模式和功能分析表明,LetAPX基因的表达受多种逆境诱导,低温、高温、盐胁迫、干旱、H2O2处理等逆境条件下过量表达对烟草具有保护作用。主要结果如下: 1.利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到叶绿体tAPX基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’片段和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长1369 bp cDNA,编码377个氨基酸的多肽。同源序列比较发现,番茄tAPX的序列与烟草、拟南芥的叶绿体APX基因的序列高度同源。该基因命名为LetAPX。 2. Northern杂交结果表明,常温下tAPX在番茄叶片中表达水平最高,其次为幼果(青)、茎、花萼,根与花中表达量最少。表达分析表明LetAPX受低温、高温、盐胁迫、水分、H2O2胁迫诱导,其表达水平随逆境处理时间的延长而变化。同时,常温下转基因烟草植株中表达水平高于野生型。 3.构建pBI-LetAPX正义表达载体,利用农杆菌介导转化烟草。利用卡那筛选,结合基因组DNA-PCR方法筛选得到转基因植株。测定了低温、高温、盐胁迫、干旱、H2O2处理等胁迫条件下APX酶活性, H2O2含量,丙二醛(MDA)含量和叶片相对电导率的变化。无论是野生型还是转基因烟草的APX活性都是先升高后降低,但转基因植株APX活性显著高于对照。同时逆境胁迫导致转基因和野生型植株叶片中的H2O2含量、MDA含量和叶片相对电导率明显增加,但在相同处理时间上,转基因植株的以上测定值均低于野生型,但转基因烟草的APX酶活性和清除H2O2的能力显著高于野生型,其膜脂过氧化程度较轻。结果表明LetAPX基因的过量表达有助于提高烟草的抗氧化能力。 4.测定了低温、高温、盐胁迫、干旱、H2O2处理等胁迫条件下的种子发芽率,结果表明转基因烟草种子发芽率明显高于野生型,可见转LetAPX基因烟草种子具有一定的耐逆性。转基因植株及野生型植株在逆境胁迫和非胁迫(对照)条件下种植,胁迫条件下野生型植株的总体生长受抑更明显,且逆境处理降低了植株的鲜重和干重,野生型植株的鲜重、干重和生长情况明显低于转基因植株。 5.与对照(正常条件)相比,低温、高温、盐胁迫、干旱、H2O2处理后,转基因和野生烟草叶片的光合速率均下降,但野生型植株下降更明显。同时,逆境胁迫下PSII的光化学效率Fv/Fm持续下降,转基因和野生型植株变化趋势相同,但转基因植株光化学效率比野生型要高。这些结果表明烟草中过量表达LetAPX在逆境条件下对光系统有保护作用,转基因烟草具有更高的耐逆性。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q943.2

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