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《山东农业大学》 2008年
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猪繁殖与呼吸综合征病毒分子遗传变异与疫苗研究

吴家强  
【摘要】: 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称“猪蓝耳病”,是目前危害世界养猪业最严重的传染病之一,在临床上以造成怀孕母猪早产、流产、死胎以及仔猪的呼吸系统症状为主要特征。本文从PRRS的血清学调查、分子遗传变异、灭活疫苗研制、混合感染和PRRSV传染性cDNA克隆等方面进行了研究和探讨。 1、PRRS血清学调查与病毒分离鉴定 为了调查山东地区PRRS的感染状况,2004年至2006年从山东各地未免疫PRRS疫苗的猪场采集1,332份血样,采用IDEXX公司的间接ELISA试剂盒进行检测。结果表明,59.5%的血清样品呈PRRS抗体阳性,其中偏远农村的散养猪场和小规模猪场只有32.5%的血清样品呈PRRS阳性,然而,从大型规模化猪场采集的血清样品中PRRS抗体的阳性比例占83.1%。从PRRS阳性的猪场样品中分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),在Marc-145细胞上呈现典型的细胞病变(CPE),但不同PRRSV分离株产生CPE的时间与类型不尽相同,并且不同分离株的毒力也存在较大差异。本研究结果表明,PRRS的流行状况与猪场规模大小和猪群密度密切相关,并且本地区猪场中存在不同表型的PRRSV分离株。 2、PRRSV山东分离株分子遗传变异研究 设计了4对PRRSV特异性引物,分别扩增5个PRRSV山东分离株的ORF5基因、ORF6基因、ORF7基因和Nsp2基因,并克隆至pMD18-T载体,送至公司测序,采用分子生物学软件分析病毒的分子遗传变异规律。序列分析表明,5个分离株ORF5基因的核苷酸序列同源性为88.2%-99.2%, ORF6基因的同源性为94.9%-99.8%, ORF7基因的同源性为93.5%-100%。其中两株PRRSV传统毒株与北美型代表株VR2332的核苷酸序列高度同源,而3株PRRSV变异株Nsp2蛋白缺失30个氨基酸,与国内以前报道的变异株JXA1株高度同源,与VR-2332株同源性相差较大。研究结果表明,山东省猪场近几年同时存在PRRSV传统毒株和变异株感染,并且近年来,山东PRRSV流行毒株有从传统美洲型向Nsp2基因缺失变异株演化的趋势。 3、PRRS灭活疫苗(SD1株)研究 在对PRRSV SD1株细胞生物学培养特性研究的基础上,我们对PRRS灭活疫苗生产工艺进行了研究,包括毒种繁殖、灭活方法、乳化工艺、安全检验与效力检验等内容。将效价大于107.0TCID50/mL的PRRSV-SD1株病毒培养液用终浓度为0.1%的甲醛于37℃灭活20 h,加入4%吐温-80作为水相,与油相(按油水比2:1的比例)于胶体磨中乳化而成。疫苗性状为油包水型,无菌检验合格,无毒副作用及其他不良反应。效力试验结果显示,当血清中和抗体效价≥1:10时,猪攻毒后表现基本正常,无不良反应。疫苗的免疫有效期可达6个月,4℃保存期暂定为12个月。田间试验和区域试验表明,母猪免疫后弱仔率、木乃伊胎率、死胎率下降约8%,仔猪成活率升高约10%,免疫猪群的中和抗体阳性率(≥1:10)可达80%以上。 4、从PRRS疑似病料中检测PCV2的研究 2005年至2007年期间从山东各地共收集156份PRRS疑似病料(组织和血清),其中102份经RT-PCR确定为PRRSV阳性。设计特异性引物,采用PCR技术,从PRRS疑似病料中检测猪圆环病毒2型(PCV2)。结果显示,有46份(29.5%)组织病料匀浆(肺、肝、脾、肾和淋巴结)为PCV2型阳性,然而,只有32份血清(20.5%)为PCV2阳性。其中,PRRS阳性病料中PCV2的阳性率为33.3%(34/102),而PRRS阴性病料中PCV2的阳性率仅为22.2%(12/54)。根据PCV2开放阅读框2(ORF2)绘制的遗传进化树分析表明,本研究中分离的PCV2核苷酸序列同源性在98.3%-100%之间,与国内外其他分离株相比,本地分离株更接近于法国分离株。研究结果表明,本地区PRRS疑似病料中PCV2的阳性率较高,而且其感染率在PRRS阳性病料和阴性病料中有着明显差异(P0.05)。 5、应用PRRSV传染性cDNA克隆构建PRRSV-PCV2重组病毒的研究 PRRSV传染性cDNA克隆的研制成功使我们能够运用反向遗传学技术对病毒的基因组进行操作,在体外转染细胞,产生带有新的遗传标记的PRRSV。在本研究中,我们对运用PRRSV传染性cDNA克隆表达外源基因进行了探讨和尝试。因为PCV2是猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要致病因子之一,而核衣壳蛋白基因(Capsid protein gene,即ORF2 gene)是PCV2的主要结构基因,其编码的核衣壳蛋白起具有重要免疫原性。在本研究中,我们首先采用PCR扩增出PCV2 ORF2基因,然后通过克隆技术插入PRRSV传染性cDNA分子克隆,转染细胞产生PRRSV-PCV2重组病毒。运用PCR技术和免疫荧光技术在重组病毒感染的细胞中成功验证了PCV2核衣壳蛋白的表达。为了进一步评估PRRSV-PCV2重组病毒的免疫原性,分别用PRRSV原始野毒和PRRSV-PCV2重组病毒各接种5头仔猪,另外一组接种Marc-145细胞培养液作为对照组。试验仔猪于第0d和第21d接种两次,颈部肌肉注射,然后分别于接种后4、7、14、21、28和35d各采血一次,检测PRRSV病毒血症持续时间和PRRSV、PCV2抗体水平。结果显示,PCV2抗体在接种后21d开始转阳,至少维持到接种后35d。与PRRSV原始野毒相比,PRRSV-PCV2重组病毒引起的病毒血症明显缩短。试验结果表明,PRRSV能够作为载体表达插入的外源基因,PRRSV重组病毒有望在不远的将来发展成为猪用多价疫苗,在临床上起到“一针防多病”的免疫功效。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S852.65

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【参考文献】
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