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《山东农业大学》 2009年
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新城疫病毒气溶胶发生与传染机制及其在生产鸡舍环境中的监测

李晓霞  
【摘要】: 畜禽传染病如新城疫(Newcastle disease,ND)、禽流感(Avian Influenza,AI)、口蹄疫(Foot-and-Mouth disease,FMD)等疾病的病原都可以通过空气传播,造成传染病的流行。2002-2003年SARS和近几年来高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)的暴发流行,警示人们应重视病毒气溶胶及其气源性传染规律的研究。ND是危害最严重的家禽传染病之一,世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health, OIE)将其定为法定报告类疫病。然而,ND传播途径研究没能得到应有的重视。Gloster (1983)通过对两起ND爆发的分析,认为ND流行主要是由气载新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的;气源传播在新城疫流行中起着重要作用。这种传播方式在1970–1971年的英格兰ND爆发和1973年北爱尔兰ND流行中起了重要作用,并已经有证据证明NDV可发生远距离的传播。以上学者的观点尽管确认了ND的气源性传染途径,然而,NDV气溶胶的发生和传染机制不详,需要实验证明。因此,开展本研究。本课题建立了NDV气溶胶发生及传播感染的实验模型,动态检测了人工感染鸡NDV气溶胶排出的时间,浓度;验证NDV F48E9株可以通过气源传播感染健康鸡群。并进一步研究了感染NDV的鸡群排出的NDV气溶胶向周围环境扩散并感染10m、20m外的鸡群;对NDV气溶胶不同感染途径的感染剂量进行对比研究;在此基础上,收集生产鸡舍中的空气,对其中的NDV进行分子检测及分离鉴定,对气载NDV分离株的部分分子特性进行了研究;应用ERIC-PCR动态监测了感染NDV气溶胶SPF鸡肠道菌群的变化。本研究不仅对深入认识ND的传染机制非常必要,而且对揭示像SARs、禽流感等气源性传染病的传播机制带来有益的启示。 1新城疫病毒气溶胶发生及其传染的实验研究 本实验建立一个NDV气溶胶发生、传播及感染的实验模型,进行实验1(T1)和实验2(T2)。隔离器A中的SPF鸡(G1)点眼、滴鼻接种NDV后用AGI-30收集A中的气体,检测气体样品中的NDV,用蚀斑计数法测定NDV气溶胶浓度;隔离器B中的SPF鸡(G2)接受气源性被动感染。定期收集实验鸡的口咽和泄殖腔拭子,检测拭子中的NDV,确定排毒情况;每7天收集实验鸡血液样品,应用HI-T检测抗体。试验结果发现:T1和T2分别在攻毒后第二天和第三天检测到NDV气溶胶,其浓度分别在第13天和第11天达到高峰,为1.69×104 PFU/m3空气和9.14×103 PFU/m3空气,到第40天NDV气溶胶浓度仍分别为6.98×103 PFU /m3空气和3.78×103 PFU/m3空气;T1G1和T2G1组鸡均在攻毒后第二天检测到排毒;T1G2组和T2G2组接受气源被动感染7天后检测分别有80%和60%的鸡排毒,抗体分别在感染后第7天和第14天呈阳性,为4.07和7.40,一直到第四十天均为阳性。 结果表明SPF鸡在感染NDV后三天内排出NDV,并能够很快形成气溶胶;NDV气溶胶能够感染健康鸡只。 2新城疫病毒气溶胶向周围环境扩散感染的实验研究 共进行两组实验,一组是新城疫病毒气溶胶向周围环境扩散的实验研究;一组是10m,20m气源传播感染实验。扩散试验时设一组SPF鸡经点眼、滴鼻接种NDV后用AGI - 30收集接种鸡处(S0)距离接种感染鸡10m (S10)、20m(S20)处中的气体,检测并定量气体样品中的NDV,揭示动物舍NDV气溶胶向周围环境的传播情形。结果表明,S0处气体样品中从接种后第3天开始检测到NDV,浓度在11天达到高峰,一直到第30天RT-PCR检测结果仍为阳性;S10处及S20处气体样品中均从接种后第5天开始检测到NDV,浓度在11-13天达到最大值,一直到第25天RT-PCR检测结果仍为阳性。感染试验时设三组试验鸡,分别为人工接种鸡(G0),点眼、滴鼻接种NDV,在距离接种鸡10m (G10)、20m (G20)处SPF鸡接受气源感染的哨兵组鸡,通过检测哨兵组鸡的排毒及抗体来确定是否发生气源感染,具体检测方法同试验一。气源扩散感染试验结果表明G10及G20持续气源被动感染7后开始检测,均检测到排毒直到第28天仍然排毒。 结果表明SPF鸡在感染NDV后三天内排出NDV,并能够很快形成气溶胶,传播扩散到20m;NDV气溶胶能够感染10m、20m处健康鸡只。 3 SPF鸡经不同途径的感染剂量及致死剂量实验研究 本实验分别通过呼吸道(通过人工发生定量NDV气溶胶感染SPF鸡)、消化道(喂服)及肌肉注射途径定量感染NDV,通过检测鸡的特异性抗体判定鸡是否发生感染,ID50、LD50计算方法采用的加权直线回归法(Bliss法)。结果表明NDV气溶胶半数感染吸入剂量为30.53 PFU,95%置信区间为9.46 - 98.54 (PFU);半数致死剂量为117.05 PFU,95%置信区间为23.71 - 577.92 PFU。NDV通过消化道半数感染灌服剂量为4419.78 PFU,95%置信区间为1095.34 -17834.14 (PFU);半数致死剂量为44743.91PFU,95%置信区间为10161.62 - 197017.62 (PFU)。NDV经肌肉注射途径半数感染注射剂量为16.63 PFU,95%置信区间为4.85 - 57.00 (PFU);半数致死剂量为69.60 PFU,95%置信区间为14.24 - 340.27 (PFU)。 结果表明不同感染途径的致病性有差异,肌肉注射致病性最强,气溶胶次之,消化道最弱。 4鸡舍中气载鸡新城疫病毒的检测及分离鉴定 本研究采用AGI-30气体收集器在五个大型鸡舍舍内收集气体(15份/舍),同时采集鸡的气管和泄殖腔拭子,采用兼并引物RT-PCR检测气体样品和拭子中的新城疫病毒(NDV),并鉴别NDV的毒力;同时分离、纯化气体样品中的NDV,用常规毒力学实验鉴别分离株的毒力。结果五个鸡舍中,在鸡舍A中,2份气体样品和4份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒,均没检测到强毒。在鸡舍B中,7份气体样品和5份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒,而仅在5份气体样品中检测到强毒;在鸡舍C中,6份气体样品和5份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒,而仅在2份气体样品中检测到强毒;在鸡舍E中,7份气体样品和1份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒,而在所有样品中均未检测到强毒。分离纯化后总共得到7株NDV,其中3株为强毒,4株为弱毒。在鸡舍A中得到一株弱毒YTCX08,在鸡舍B中得到一株强毒DZ07和一株弱毒DZ0702,在鸡舍C中得到2株强毒MH07和MH0702和1株弱毒MH0703,在鸡舍E中得到一株弱毒NY06。结果表明兼并引物RT-PCR可快速、直接对气体样品进行检测及鉴别诊断,有助于ND的防治。 5气载新城疫病毒野毒株F基因重要片段的克隆及遗传变异分析 根据已发表文献针对新城疫病毒(NDV) F基因序列设计了1对引物,对从气体中分离的7株NDV毒株的F基因重要功能区片段扩增进行了扩增和序列测定,并与多株已报道的NDV参考株相应片段进行序列比较,经遗传基因进行化树分析。结果表明,七株气载新城疫病毒分离株之间的同源性为79.3% - 100%;氨基酸的同源性为77.4% - 100%,分离到的四株野毒NY06、MH0703、YTCX08与DZ0702均属于基因II型,在裂解位点的氨基酸序列(111GGRQGRL117)与NDV弱毒株特征相符合;MH07属于基因IX型;DZ07、MH0702均属于基因VII型,这三株在裂解位点的氨基酸序列( 111GRRQK RF117 )与NDV强毒株特征相符合。 6新城疫病毒气溶胶感染SPF鸡肠道菌群结构变化的研究 SPF鸡定量感染NDV气溶胶后,定期采集试验鸡的粪便,检测其中大肠杆菌的浓度变化,同时应用ERIC-PCR对肠道菌群结构进行了动态检测;同时对健康鸡进行同样研究作对比。结果表明,通过与对照组肠道大肠杆菌的检测比较,结果大肠杆菌在感染初期高于对照组(P0.01),而严重感染开始出现死亡时开始降低,明显低于对照组(P0.01),恢复期大肠杆菌总数开始回升,与对照组差异不显著(P0.05)。ERIC-PCR结果比较发现NDV气溶胶感染组鸡只与同日龄对照组鸡肠道菌群的图谱间有一定的差异。在大多数鸡群出现临床症状(2-10天)菌群结构也发生了改变,在恢复期(10-15天)菌群重新建立,并有一个重新选择的过程,到完全恢复后菌群结构基本稳定。 结果表明感染NDV气溶胶后鸡群肠道菌群发生了改变,采用ERCI-PCR指纹图谱技术可以动态监测动物肠道菌群结构变化。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
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【参考文献】
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9 陈钟鸣;刘怀然;孙敏华;戴鼎震;张春杰;张志成;方光远;孔宪刚;;不同禽源新城疫病毒分离株F基因遗传变异分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
10 郑腾;程龙飞;李志方;柯美峰;黄瑜;李文杨;施少华;;猪源新城疫病毒SP13株的F基因克隆及序列分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 王艳红;ORF基因能让西红柿可大可小[N];新华每日电讯;2000年
2 惠岭;鹧鸪新城疫咋防治[N];河北农民报;2006年
3 吕纪增;鹧鸪新城疫的防治[N];中国畜牧兽医报;2006年
4 张艺兵 黄丛平;山东局推广RT-PCR检测方法[N];中国国门时报;2004年
5 河北省辛集市畜禽科技服务中心 肖亚彬 任灵霞 梁剑峰;蛋鸡传喉和新城疫混合感染[N];江苏农业科技报;2006年
6 扬州大学畜牧兽医学院病原微生物研究室 王永坤教授;新城疫有新动向 防制对策需跟上[N];中国畜牧报;2002年
7 郑安明;美国研制成功新一代新城疫疫苗[N];中国国门时报;2006年
8 清苑职教中心 张俊杰;当前流行鸡病好难治[N];河北农民报;2006年
9 中国科学技术信息研究所;墨西哥育出新城疫疫苗玉米[N];农资导报;2006年
10 哈冰;揭开新城疫病毒奥秘的曹殿军[N];农民日报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李晓霞;新城疫病毒气溶胶发生与传染机制及其在生产鸡舍环境中的监测[D];山东农业大学;2009年
2 姜永厚;新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究[D];东北农业大学;2000年
3 耿捷;基因芯片检测新城疫病毒和PCR结合内切酶分析鉴别新城疫强弱毒株的研究[D];西北农林科技大学;2004年
4 程相朝;新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制[D];南京农业大学;2003年
5 秦卓明;新城疫病毒流行株致病性和抗原性及其与F和HN基因变异的相关性[D];山东农业大学;2006年
6 胡海霞;表达C亚型禽偏肺病毒糖蛋白和融合蛋白的重组新城疫病毒二价苗的构建及免疫效力评价[D];吉林大学;2011年
7 邵朝纲;水稻齿叶矮缩病毒的分子生物学研究及新城疫病毒检测新技术[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
8 智海东;表达新城疫病毒F基因和传染性喉气管炎病毒gB基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D];中国农业科学院;2002年
9 万洪全;鹅源新城疫病毒部分生物学特性鉴定及其囊膜糖蛋白基因序列分析[D];扬州大学;2002年
10 韦栋平;共表达新城疫病毒融合蛋白基因和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力[D];扬州大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 谭伟成;新城疫病毒玉林株的分离鉴定与油乳剂灭活疫苗的研制[D];南京农业大学;2007年
2 李杰峰;鸡新城疫病毒地方株的分离鉴定及其HN基因的克隆与序列分析[D];河北农业大学;2006年
3 曲鲁江;新城疫病毒单克隆抗体的建立及其遗传变异分析研究[D];新疆农业大学;2001年
4 米志强;新城疫病毒昌黎株F基因的序列分析、表达及重组病毒免疫原性的研究[D];中国人民解放军军需大学;2001年
5 张伟;鹅副粘病毒F基因的克隆、分析及核酸探针检测方法的建立[D];山东农业大学;2008年
6 邓明俊;新城疫病毒F基因真核表达质粒的构建及动物免疫试验[D];西北农林科技大学;2003年
7 巩艳艳;抗体免疫选择压作用下新城疫病毒HN基因和F基因的变异[D];山东农业大学;2010年
8 徐守振;NDV Sddy-02株F基因的克隆与序列分析及E.coli CpG-DNA在新城疫疫苗上的应用研究[D];山东农业大学;2003年
9 宁军;新城疫病毒F基因乳酸菌表达载体的构建与表达[D];吉林农业大学;2008年
10 王青;新城疫病毒F基因在真核及原核表达系统中的表达[D];西北农林科技大学;2007年
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