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鸭圆环病毒的分子流行病学调查及诊断方法的建立

张兴晓  
【摘要】: 鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的一新成员,2007年ICTV(The International Committee on Taxonomy of Viruses)将DuCV列入圆环病毒属中的暂定种。DuCV感染可导致鸭子羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻等症状。本文拟从DuCV的流行病学调查、克隆测序及分子遗传变异、人工感染的病理组织动态变化、建立血清学检测方法和体外组织细胞培养等方面进行研究和探索。 1、山东省樱桃谷鸭群中鸭圆环病毒及混合感染的流行病学调查 本研究旨在调查中国山东省樱桃谷鸭(Cherry Valley ducks)群DuCV的感染与流行情况。2006-2007年间,从山东省70个樱桃谷肉鸭养殖场随机选取742只鸭,采用PCR和Dot-blot方法,对DuCV感染情况进行流行病学调查。结果显示,被调查鸭中有33.29%感染了DuCV;3、4周龄的鸭子较2周龄的更易感;PCR鉴定方法比Dot-blot敏感。此外,与DuCV阴性鸭比较,DuCV阳性鸭与鸭1型肝炎(25.50%vs7.47%)、鸭疫里默氏菌(23.48%vs8.28%)及大肠杆菌(16.19%vs4.85%)的混合感染率较高。调查显示,DuCV在樱桃谷鸭群中普遍存在,且DuCV呈阳性的鸭更易与其它病原发生混合感染。 2、鸭圆环病毒的克隆测序及序列分析 从中国大陆樱桃谷鸭中得到LY0701、WF0701两株DuCV的全基因组,Genbank登录号分别为EU022374,EU022375。基因序列特征分析表明,这两株病毒的基因组均具有以下分子特征:(1)颈环结构;(2)滚环复制;(3)四个重复序列;(4)两个主要开放阅读框,分别编码复制蛋白Rep基因和编码衣壳蛋白Cap基因。通过与已发表的序列比较分析,所分离的两株病毒分别在两个分支上,LY0701株与台湾T1、T2、T3株、中国LY0701同源性高达96.7%以上,位于一个分支上,WF0701株则与美国株、德国株以及台湾的T4株更为接近,同源性达到93.5%以上,位于另一分支上。 3、樱桃谷鸭人工感染鸭圆环病毒的病理动态变化 本研究以已经完成全基因组序列测定的LY0701株DuCV为研究材料,利用感染LY0701株的阳性病料人工接种DuCV阴性的3周龄健康雏鸭,分别于攻毒后第2、4、6、8周对发病鸭进行病理观察。结果表明,与对照组相比,LY0701株阳性病料感染的雏鸭临床症状均出现发育不良,消瘦,羽毛凌乱等现象。剖检显示胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏不同程度出血、肿胀,其它内脏器官病变不明显。病理切片显示胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏出血,淋巴细胞坏死、崩解等变化。 4、DuCV Cap蛋白基因原核表达及产物免疫原性研究 根据已发表的DuCV LY0701株Cap基因序列,设计一对引物,以测序正确的LY0701株Cap基因质粒为模板,扩增出相应的基因片段,以pGEX-6P-1为载体进行连接,转化大肠杆菌BL21株,挑选阳性克隆,测序验证正确后,分别进行原核表达。SDS-PAGE电泳表明,表达产物的条带大小与理论值相符。利用原核表达产物免疫BALB/c小鼠,制备抗Cap蛋白的血清,标记为Ab-Cap。以FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,建立了间接免疫荧光染色法(IFA)。利用Ab-Cap对人工感染病料的检测表明,在脾脏、法氏囊、胸腺、肝脏的冷冻切片中可检测到被荧光染色的完整的细胞;在心脏、肺脏、肾脏等病料中未检测到荧光染色的阳性细胞。 为进一步确定IFA检测的敏感性,临床上分别收集疑似DuCV感染的96只鸭子的胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏、骨髓,利用IFA进行DuCV检测。结果表明,当鸭子感染DuCV后,脾脏的病毒检出率最高,达到18.75%,其它脏器的病毒检出率从高到低依次为法氏囊、肝脏、胸腺。利用Ab-Cap对临床病例检测表明,该方法更适合用于8周龄以上鸭子的脾脏检测。 5、DuCV在不同组织及细胞中培养的探讨 对PCR检测DuCV强阳性的5份病料(LQ76,LQ66,LQ14,LY5,WS23)进行处理并(1)通过鸭胚的卵黄囊、绒毛尿囊膜、尿囊腔等组织进行接种,(2)鸭胚成纤维细胞、鸭胚肝细胞、鸭胚肾细胞、鸭胚脾细胞接种阳病料组织,将收获的组织和细胞培养物连续盲传10代,将各代次培养物利用PCR、电镜、间接免疫荧光染色法(IFA)进行鉴定。结果表明,利用上述组织和细胞对鸭圆环病毒进行培养,未能获得成功。


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